?；w結構對褶皺念珠菌脂肪酶(CRL)催化芳香仲醇動力學拆分立體選擇性的影響

戴曉庭，徐 剛，陳永軍，吳堅平，楊立榮

(浙江大學 化學工程與生物工程系，杭州 310027)

手性仲醇是合成醫藥、農藥化學品、生活用品、信息素和高質量液晶等不可缺少的中間體，也是不對稱合成中的重要手性輔劑［1］。獲得這些光學純化合物的主要方法有不對稱合成法、化學拆分法、酶拆分法以及色譜拆分法等。其中酶法動力學拆分(kinetic resolution，KR)因其高效、反應條件溫和、對環境友好等優點深受人們的青睞，成為近年來的研究熱點［2－7］。在以往的酶催化動力學拆分的研究中，所使用的?；w只有確定的幾種［8］，而針對供體改變對動力學拆分影響的報道則未作系統的研究。

研究發現，共價催化是脂肪酶催化手性仲醇實現選擇性轉酯化反應的典型機制［9－10］。共價催化的最一般形式是催化劑的親核基團對底物中親電性的碳原子相互作用。在酶催化的轉酯化反應過程中則表現為(圖1):脂肪酶活性中心的具有親核性的氨基酸殘基(a 1)與?；w中的?；糠址磻?，通過氫鍵作用，形成不穩定的四面體過渡態結構(a 2)，當四面體中間體結構中離去一個醇分子后，就形成了帶有親核基團的?；苌?a 3);接著，這種酶的?；苌镒鳛橐粋€共價中間物與被拆分的外消旋體醇起作用;?；鶑挠H核的催化劑上轉移到最終的?；荏w即外消旋體醇的特定的一個異構體上(a 4)。

在共價中間體(a 3)形成的過程中，脂肪酶與?；w相互作用，構象雙雙發生變化，形成了特定的空間結構。這樣，只有與之契合的某一構型的底物才能被催化發生酯化反應，從而達到動力學拆分的效果。

圖1 酶催化轉酯化反應機制Fig.1 Reaction mechanism of serine hydrolase catalyzed esterification

由圖1的機制模型可以看出，在KR過程中，?；w對酶的催化選擇性具有極大的影響，而供體中?；糠炙鸬淖饔糜葹橹匾?，?；w中R'的結構將影響共價中間體(a 3)的結空間構象，從而影響到酶的催化選擇性，這也是本研究的切入點。

在以往的KR研究過程中，乙酸乙烯酯、乙酸異丙烯酯以及對氯苯酚乙酸酯是最為常見的酶拆分?；w［8］。相對于乙酸乙烯酯和乙酸異丙烯酯來說，對氯苯酚乙酸酯在仲醇的酶拆分過程中，表現出更快的反應速率和更好的底物適用性［8］。所以，在本研究過程中，選擇對氯苯酚的各種酯作為供體，研究供體?；淖儗γ复呋瘎恿W拆分選擇性的影響。

1 實驗部分

1.1 CRL催化仲醇的KR反應

反應在10 mL的封閉三角瓶中進行。典型反應條件:2 mL溶劑(分析純，分子篩脫水后使用)，100 mmol/L仲醇(購自百靈威化學技術有限公司)，300 mmol/L?；w，30 mg/mL脂肪酶CRL(Candida rugosa lipase)，40℃，轉速200 r/min。間隔取樣分析。

1.2 放大的1－苯乙醇的KR反應

反應在100 mL的封閉三角瓶中進行。操作條件:3.05 g 1－苯乙醇(購自百靈威化學技術有限公司)，2.39 g正戊酸對氯苯酚酯，0.5 g脂肪酶CRL，甲苯定容至80 mL，將反應體系置于40℃、轉速200 r/min的搖床中。間隔2 h取樣分析，待?；w反應完全后，終止反應。過濾、濃縮后，采用正己烷與乙酸乙酯(體積比為10∶1)的展開劑進行柱層析純化，最終可以得到純的單一構型的產物。

1.3 分析條件

采用Fuli 9790型氣相色譜(溫嶺福立分析儀器有限公司)分析試樣中各組分含量，10%甲基β－環糊精手性柱。色譜條件:汽化溫度230℃，檢測溫度230℃，柱溫80℃，載氣N2流速為45 mL/min。

底物對映體過量值e.e.S=(cSS－ cSR)/(cSR+cSS)×100%，產物的對映體過量值 e.e.p=(cPR－cPS)/(cPR+cPS)×100%，轉化率根據底物的減少計算而得。式中cSS、cSR、cPR和 cPS分別為 S醇、R醇、R酯和S酯的含量。

2 結果與討論

2.1 CRL催化1－苯乙醇在不同供體下的KR反應

將對氯苯酚確定為?；w中醇的部分，并針對供體的?；糠诌M行規律性的擴展，制備了一系列具有不同碳原子數側鏈的?；w，并將它們用于1－苯乙醇的動力學拆分過程，結果見表1。

表1 不同供體下1-苯乙醇的KR反應Table 1 KR of 1-phenylethanol with different acyl donors

由表1可知:供體中?；糠值慕Y構改變對酶催化動力學拆分選擇性具有極大的影響。當?；w醇的部分不變時，隨著?；刻荚肿訑档脑黾?，產物的e.e.p值在不斷提高。當選擇對氯苯酚丁酸酯作為供體，反應6 h后，底物轉化率達到53.2%，產物的e.e.p值只有 87.1%，而選擇對氯苯酚戊酸酯作為供體，底物轉化率達到50%，產物的 e.e.p值接近100%。如果?；鶄孺湹奶荚訑道^續增加，產物e.e.p值也會近于100%。因此可以得知，?；糠值慕Y構變復雜會使得動力學拆分過程的選擇性更高，出現這種現象的原因是復雜的?；Y構會讓共價中間物的空間結構更具特異性，對與之契合的底物空間構象要求更嚴格，從而提高了動力學拆分的選擇性。

2.2 CRL催化的1－苯乙醇衍生物的KR反應

長鏈有機酸的對氯苯酚酯在1－苯乙醇的KR過程中，表現出了優異的性能。為考察這類供體的底物適用性，選擇對氯苯酚戊酸酯作為模型供體與不同的仲醇進行反應，結果見表2。

由表2可知，對氯苯酚戊酸酯可以很好的應用于各種仲醇的KR過程。使用對氯苯酚戊酸酯為供體時，能使各種仲醇在50%轉化率的情況下，e.e.p值保持近于100%。由表2還可以得知，底物結構同樣會對KR過程產生影響。這主要體現在兩個方面:一是電子效應，相同位置上的取代基，缺電子取代基的電子效應會減慢KR的反應速率，而且取代基的吸電子能力越強，反應速率受到的影響也就越大。二是位阻效應，在對氯苯酚戊酸酯為供體的動力學拆分過程中，雖然位阻增大，e.e.p值沒有明顯的變化，但是反應速率卻受到比較明顯的影響。

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2.3 放大的1－苯乙醇的KR反應結果

當轉化率達到43%，停止反應，減壓蒸餾后經硅膠層析處理，得到R－1－苯乙醇正戊酸酯1.95 g。經最終檢測發現，所得產物為單一構型，測其旋光為=69.1(c 1.00，CH2Cl2)。在此反應中，加入的?；w與底物的摩爾比約為0.45∶1，這是因為要保證反應在結束以后，整個體系中沒有?；w的殘余，否則?；w會與產物在純化時，難以分離。

3 結論

通過研究酶催化轉酯化反應的機制，明確了?；w結構對仲醇動力學拆分選擇性的影響，同時參考以前研究中所使用的幾種供體，選擇對氯苯酚的有機酸酯作為拆分過程中所使用的供體。在此基礎上，通過改變供體?；糠值膫孺溄Y構，從而發現對氯苯酚有機酸酯供體中?；糠痔荚訑底兓瘜?－苯乙醇動力學拆分結果有著極大的影響，隨著側鏈碳原子數增加，產物的e.e.p值會不斷地提高。當供體側鏈碳原子數大于或等于5時，1－苯乙醇轉化率達到50%時，產物的e.e.p值仍能保持近于100%。將對氯苯酚戊酸酯作為供體用于其他仲醇的KR時，也取得了相同的效果，實現了這些仲醇的高效拆分，保證了50%的轉化率以及100%的產物e.e.p值。這為使用長鏈有機酸酯作為供體為提高仲醇動力學拆分的效率提供了一條新思路。

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