研究表皮黑素細胞與毛囊角質形成細胞在接觸性共培養體系中的相互作用

許小標 解士海 楊觀招

（廣東省惠州市皮膚病醫院，廣東 惠州516001）

研究表皮黑素細胞與毛囊角質形成細胞在接觸性共培養體系中的相互作用

許小標 解士海 楊觀招

（廣東省惠州市皮膚病醫院，廣東 惠州516001）

目的研究分析表皮黑素細胞和毛囊角質形成細胞在接觸性共培養體系的建立，以及相互作用。方法用胰酶融化游離毛囊與包皮的表皮，獲得純度角度高的角質形成細胞與黑素細胞，第三代毛囊角質形成細胞在6孔板中接種，2 d以后按照表皮黑素細胞與毛囊角質形成細胞之間的比例，按照1∶2、1∶10、1∶20的比例接種黑素細胞，其中在1∶10的比例中，加入-黑素細胞刺激素，在干預6 d以后，用NKI/beteb作一抗。結果以1∶10的接種比例，很符合表皮基底層的黑素細胞與角質形成細胞比例；但是在1∶2情況下可獲得數量多的表皮黑素細胞。而在1∶20情況下可以發現角質細胞、黑素細胞之間的聯系。結論表皮黑素細胞與毛囊角質形成細胞在接觸性共培養體系下，非常適合用于人色素系統方面的研究。

表皮黑素細胞；毛囊角質；細胞；黑素細胞

表皮黑素細胞在人體內的生長常常需要和角質形成細胞合并在一起，共同調節生理性質的黑素細胞和角質形成細胞在培養體系中的比例[1]。用毛囊角質形成細胞研究，能夠充分利用增殖能力較強的毛囊角質形成細胞和表皮黑素細胞一起培養，觀察不同比例條件下良種細胞生長情況以色素調節劑對黑素細胞的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

頭皮與包皮來自整形外科，在包皮環切術中取得。試劑采用華美生物工程公司制造的SP免疫組化檢測試劑盒，人黑素細胞培養基，人表皮細胞培養基、質形成細胞、以及黑素細胞生長添加成分都來自Cascade生物公司。

1.2 方法

1.2.1 表皮黑素細胞的培養

將包皮標本放入水中浸泡、沖洗，然后剪掉皮下組織，切成大約（5×3）mm的細條，在分離酶Ⅱ中溫度為37 ℃情況下消化2 h左右，分離獲得表皮，在胰酶37 ℃條件下消化10 min，過了200 d以后進行篩網過濾，得到單細胞懸液，以完全黑素細胞培養基添加生長大約是5 mL，其主要成分為：氫化可松、胎牛血清等[2]，調整細胞按照6× 105/mL的標準接種，隔2 h以后換液，等到8 d以后黑素細胞形成網狀，用胰酶處理，先消化下黑素細胞懸液，殘留的貼壁牢固的表皮角質組成細胞，選擇純凈表皮黑素細胞，進行培養，第三代細胞作為備用。

1.2.2 毛囊角質形成細胞培養

選用帶毛囊的頭皮，用碘伏浸泡，用生理鹽水沖洗約10 min，清理掉表皮與真皮，把含有毛囊的真皮放在含青霉素400 U/mL與鏈霉素的培養基中進行漂洗大約10 min，在放進2.4 U/mL的分離酶Ⅱ中，溫度設定為37 ℃，進行消化4 h左右，然后觀察頭皮松散程度，待完全松散后，用醫學常用鑷子拔出頭皮中的毛囊，用濃度為5%的胰酶消化毛囊為5～10 min，經過銅網把毛發的殘渣過濾掉，提取出純粹的單細胞液體，再使用完全的表皮細胞培養出添加的角質，其成分主要為牛胰島素5 μg/mL、牛轉移因子5 μg/mL等，在10 d過后，按照80%的比例融合，含有少量黑素細胞。用胰酶處理，消化掉殘留的角質細胞。

1.2.3 接觸性共培養

把第3代皮黑素細胞以2.5×104mL、2.5×103mL和5×103mL和第二代毛囊角質形成細胞接種，在生長2 d以后的6孔培養板內，讓表皮黑素細胞和毛囊角質形成細胞接種比例約為1∶2、1∶10、1∶20。采用的共培養基是黑素細胞培養基、角質形成細胞培養基形成的混合物，隔兩天換一次液，每天認真觀察。在共培養體系中選取表皮黑素細胞和毛囊角質形成細胞比例為1∶20的一組，和不添加任何藥物的一組進行比較[3]。在培養黑素細胞過程中選用第三代表皮黑素細胞，在不間斷進行藥物干預，觀察黑素細胞形態的變化，當干預6 d以后，取出蓋玻片，放入PBS內，過了5 min后，用冷乙醇固定約10 min，進行自然干燥，用NKI/beteb稀釋一百倍當作一抗。最后在顯微鏡下面認真觀察后攝片。

2 結 果

表皮黑素細胞培養基以及添加成分比較有利于黑素細胞的貼壁、增殖，在進行換液過程中可以去掉培養基中很多毛囊角質形成的細胞懸浮，基本上不會出現纖維細胞污染的情況。用胰酶處理第二代毛囊角質形成細胞融合效果良好。以1∶10的接種比例，很符合表皮基底層的黑素細胞與角質形成細胞比例；但是在1∶2情況下可獲得數量多的表皮黑素細胞。而在1∶20情況下可以發現角質細胞、黑素細胞之間的聯系。

3 討 論

表皮黑素細胞和毛囊角質形成細胞在接觸性共培養體系中，非常有利于發揮角質形成細胞對黑素細胞的控制作用，且建立生態體系下的共培養體系，對色素性疾病發病機制研究非常重要。在本次研究中我們發現：①毛囊外根鞘內部出現了大量的角質形成細胞，并且在隆突的位置還出現了沒有分化的肝細胞，這些細胞增殖很快[4]。②在毛囊外部生成的黑素細胞較少，相應的污染率低。③采用毛囊標本很方便，醫師很容易采集到足量的合適毛囊，進而培養出角質形成細胞[5]。

在本次研究中，角質形成細胞在定植時需要的時間比黑素細胞長，呈小片狀的生長方式，在2 d以后再次接種黑素細胞，非常有助于細胞生長。其中黑素細胞：角質形成細胞為1∶20，如果要獲得大量的黑素細胞，可選用1∶2的比例，篩選色素調節劑，盡量模擬生理狀態，那么在這種情形下接種比例保持1∶10最好。在角質形成細胞的周圍黑素細胞呈現樹狀突出效果更明顯，這可能是因為角質形成細胞能夠釋放一定數量的黑素細胞刺激素，起到促進黑素生成的效果，然后在共培養體系中發揮了更明顯的作用。在本次研究中，清晰地看到了在公培養體系下黑素體的3種運轉方式，但是有個別囊袋狀頂端已經脫離了黑素細胞，這是一種偶然的黑素細胞分裂現象，還是黑素體的新型運轉方式，目前尚不明確?？傊?，表皮黑素細胞與毛囊角質形成細胞在接觸性共培養體系下，非常適合用于人色素系統方面的研究。

[1] 江蕾薇,陸洪光.人表皮黑素細胞與角質形成細胞體外共培養模型的構建[J].貴陽醫學院學報,2010,2(2):54-55.

[2] 邵麗芳,趙廣.黑素細胞功能相關性細胞因子的研究進展[J].中國皮膚性病學雜志,2011,4(5):68-69.

[3] Duval C,Smit NP,Kolb AM,et al.Keratinocytes control the pheo/eumelanin ratio in cultured normal human melanocytes[J]. Pigment Cell Res,2002,15(6):440-446.

[4] Greatens A,Hakozaki T,Koshoffer A,et al.Effective inhibition of melanosome transfer to keratinocytes by lectins and niacinamide is reversible[J].Exper Dermatol,2005,30(6):619-767.

[5] 張汝芝,朱文元,馬佳.表皮黑素細胞與毛囊角質形成細胞性共培養方法的建立[J].中華皮膚科雜志,2006,39(10):596-598.

R329.4

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1671-8194（2014）11-0066-02