共培養技術在耳軟骨再生中的應用及展望

林陽洋 潘博

中國醫學科學院整形外科醫院整形七科

小耳畸形的治療是整形外科的重點和難點，在我國發病率約為3.06/10 000[1]。目前有三種耳廓重建方法:自體移植物，人造移植物和外部假體移植。然而，自體肋軟骨雕刻難度較高，且可造成胸廓畸形;而人工支架植入可有感染、移植物排斥和外露等風險。需要更好的耳廓重建方案[2]。組織工程制作耳廓軟骨植入物，可以避免上述風險，應用前景廣闊。種子細胞是組織工程技術中所用到的所有細胞的總稱。如何獲得足量的耳廓軟骨種子細胞（Auricle Chondrocytes，AuCs）進行組織工程耳再造仍有待進一步研究。間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）可以分化成軟骨細胞，作為軟骨工程種子細胞的替代來源。單獨培養轉化軟骨細胞或MSCs需要較長的時間，增加了感染的風險，分化方向難以控制，常伴有肥大，繼而鈣化，導致力學性能不佳。所以單一使用軟骨細胞或MSCs目前對頭頸區域的基于細胞的軟骨修復并不理想[3]。面對細胞單獨培養的困境，軟骨組織工程提出了共培養體系。本文對共培養體系在軟骨再生中的應用進行了全面的綜述，并比較了直接共培養體系和間接共培養體系的差異，討論了其潛在的機制及新的進展。共培養研究在關節軟骨（Articular Chondrocytes，ACs）等生物工程領域得到大量應用，相應的進展給耳廓軟骨生物工程帶來很多啟發。

1 共培養體系

共培養體系即是建立類似于體內環境的培養體系，盡可能使體外環境與體內環境相吻合，從而使細胞間能相互溝通信息，相互支撐生長增殖，在細胞培養技術的基礎上發展出了細胞共培養技術。而細胞共培養技術是將2種或2種以上的細胞共同培養于同一環境中，由于其具有更好地反映體內環境的優點，所以這種方法被廣泛應用于現代細胞研究中。傳統軟骨組織工程以自身軟骨細胞作為種子細胞，存在來源不足等問題，限制了其臨床應用。近年來，多種來源的干細胞因其較強多向分化潛能、易從身體不同部位大量獲取等優點，成為軟骨組織工程種子細胞的新來源?；诟杉毎墓才囵B體系給軟骨組織工程研究提供了新的方法。

共培養體系可以獲得充足的軟骨工程種子細胞數量，具有減少軟骨細胞的去分化等明顯的優勢。然而，大多數關于共培養的研究是基于顆?；蛭⒘颗囵B的ACs，對MSCs/AuCs共培養和共移植軟骨形成的研究還很少。Dlk1在成年豬AuCs中強烈表達，表明成熟AuCs與關節軟骨中增殖/前增生性區域的ACs處于相似的狀態[4]。ACs共培養的研究成果可能為工程耳軟骨的臨床轉化提供有希望的策略。

組織工程再生耳至少需要1.5億個AuCs，但最初只能分離出200萬個AuCs。盡管AuCs增殖穩定，但在重復單層傳代過程中，軟骨細胞表型和能力迅速喪失，這是一種常見的去分化現象，很難避免。最終，去分化導致纖維軟骨形成，其功能遠不及透明軟骨。Zhang等人利用小耳畸形耳廓軟骨細胞和牛MSCs共培養發現，盡管小耳畸形耳廓軟骨細胞有很強的增殖能力，但是在3代以后的單獨重復傳代中，其成軟骨能力迅速喪失[4]。

研究如何在獲取充足的軟骨種子細胞數量的同時避免或減少去分化程度對耳廓軟骨組織工程具有重要意義。關于MSCs在共培養介導的軟骨形成中的作用和機制，目前有兩種觀點。一個觀點是MSCs可由軟骨細胞誘導并可直接轉化為軟骨細胞樣細胞，通過骨髓MSC（bMSCs）標記、transwell分離共培養、軟骨細胞條件培養基等多種方法得到證實；另一個觀點是MSCs可以通過營養效應促進軟骨細胞的增殖和軟骨特異性（extracellular matrix，ECM）的產生。因此，這兩種機制很可能是共存的，MSCs和軟骨細胞可能是相互協同的。共培養對軟骨形成的作用機制尚未完全闡明。為了探討細胞間在共培養體系中的相互作用、可行性和有效性，Jianyu Zou等[5]提出了兩種共培養體系，即直接共培養體系和間接共培養體系，有助于揭示共培養體系在軟骨再生中的機制，為共培養體系在軟骨組織工程中的應用提供了理論支持。通過共培養策略建立基于MCs和干細胞的、成本更低、軟骨形成更穩定的軟骨組織再生技術，可以為工程人耳軟骨組織的臨床轉化提供一種促進策略。

2 直接共培養體系與軟骨再生

直接共培養體系是將兩種或兩種以上的細胞均勻混合，不同來源的細胞密切接觸，通過表面受體和分泌的各種細胞因子相互作用。直接共培養體系可以進一步分為單層直接培養（細胞直接混合），以三維直接培養（包括支架或水凝膠共同培養）。與單層培養相比，三維培養能較好地維持軟骨細胞的自然表型[6]。近年來，利用水凝膠顆粒作為共培養支架成為研究熱點。軟骨細胞-軟骨細胞共培養，以及軟骨細胞-間充質干細胞共培養，前者研究較少，研究主要集中于軟骨細胞和MSCs的結合。

2.1 直接共培養體外研究

大多數ACs可以被bMSCs替代，緩解軟骨細胞分離和擴張帶來的問題。無論去分化處于哪個階段，在合適的誘導培養基中，去分化牛ACs細胞與兔bMSCs共培養均可產生軟骨形成[7]。與單一培養相比，共培養的牛ACs和兔bMSCs對TGF-β3有更高的敏感性[8]。與MSCs共培養時，軟骨細胞表型更加穩定，Col II、糖胺聚糖和轉錄因子Sox9增加[9]。共培養顯著減少了所需的軟骨細胞數量，增強了MSCs的軟骨形成，減少了體外增殖過程中的去分化，避免了纖維軟骨的形成[10]。兩種細胞類型之間的密切接觸是共培養的先決條件，這種相互作用改善了受體MSCs的生存能力、軟骨形成、基質形成和穩態。細胞內的內容物從共培養的軟骨細胞向向鄰近的MSCs轉移，而抑制胞外囊泡(EV)轉移阻礙了共培養的協同作用，EV可能是這些共培養中主要的交流方式[11]。

很多實驗研究關注共培養的比例問題。多數研究提示軟骨細胞和MSCs（1:1）效果最佳，而另一些表明1:3、3:7和1:4比例可以產生更高的聚集蛋白和膠原蛋白含量。Elhussein Elbadry Mahmoud甚至嘗試了多種干細胞共培養的方案，bMSCs和滑膜間充質干細胞sMSCs（1:1）兩種細胞混合的抗炎特性有望改善骨關節炎的臨床癥狀。之后需要進一步的研究來評估共培養體系中最佳的sMSCs/bMSCs比例，以便在體內和體外通過長期評估來評估骨軟骨發育潛能[12]。以上體外ACs和bMSCs的共培養可減輕工程關節軟骨的肥大，增強其功能特性。在耳廓軟骨組織工程方面，u Zhang[13]等采用AuCs：bMSCs（1:3）共培養，結果表明MCs具有很強的軟骨誘導能力，可以促進bMSCs在皮下環境中穩定的異位軟骨形成?？祵嶽4]等發現1:1組工程軟骨彈力蛋白密度最大，楊氏模量最高。Ki67和Dlk1的表達增強，顯示工程軟骨較好的增殖和成軟骨潛能。Dlk1是Notch/Delta/Serrata家族的跨膜蛋白，被認為是軟骨祖細胞的標記物，在小鼠肢體軟骨內成骨過程中由增生性向增生性前軟骨細胞過渡的細胞中特異性表達。Dlk1在成年豬耳軟骨細胞中強烈表達，表明成熟耳軟骨中的軟骨細胞與關節軟骨中增殖/前增生性區域的軟骨細胞處于相似的狀態。LMieke M.Pleumeekers等[3]將牛AuCs和人bMSCs（1:4）包覆在海藻酸水凝膠中，發現產生的軟骨基質成分與100%牛軟骨細胞對照組相當。然而該共培養體系非常脆弱，外植體未顯示軟骨樣外觀，這對其結果的持久性產生了疑問[3]。相比之下，Kerry A Morrison等[14]在I型膠原蛋白水凝上共培養牛AuCs和牛bMSCs（1:1），發現產生的彈性軟骨甚至比100%AuCs培養物更強健，表明MSCs的存在引發了耳廓軟骨合成。在AuCs和bMSCs共培養的研究中，1:1的比例較為多見，且均顯示良好的結果，因此從現有證據看，1:1的比例較為適宜AuCs和bMSCs的共培養研究。

除骨髓外，脂肪MSC（ADSCs）和軟骨細胞共培養,可定向分化為軟骨細胞。ADSCs與ACs以不同比例直接共培養于膠原／透明質酸構成的3D支架中35天，1:3共培養組人ADSCs的Sox9、糖胺多糖含量最高，Ⅹ型膠原表達量最低。耳軟骨也可采用ADSCs進行共培養，且以3:7的比例相對多見[15,16]。有一篇報道[17]嘗試1:5和1:10的比例直接共培養AuCs和ADSCs，也可以得到軟骨組織，但是觀察時間較短，構建物數量較少，分子機制有待進一步揭示。

有研究嘗試臍血或臍帶來源的MSCs（umbilical cord mesenchymal stem cells，uMSCs）與 ACs共培養。uMSCs：MSCs（1:1和1:3組）細胞支架復合體總蛋白量高于其他組[17]。將uMSCs和人ACs（5:1）直接共培養，可明顯促進人uMSCs向軟骨樣細胞誘導分化，并有效抑制細胞纖維化，縮減軟骨細胞用量[19]。1:1的比例下，即使低密度共培養（比其他共培養研究低約400倍），依然有充足的軟骨產生和良好的再分化效果。然而，也有uMSCs與ACs共培養成軟骨能力較差的報道[20]。未來的實驗需要進一步研究uMSCs分泌的特異性細胞因子及其信號通路。uMSCs來源的研究展示出良好的抗炎和抗去分化的特點，大多數uMSCs共培養中的成軟骨能力優于bMSCs，且所需軟骨細胞比例小于bMSCs和ADSCs共培養，可以考慮uMSCs在耳廓工程中嘗試應用。

2.2 直接共培養動物體內研究

隨著體外研究取得進展，出現了越來越多的動物體內共培養構建的嘗試。兔MSCs及軟骨細胞（3:1）混合接種于PGA(聚羥基乙酸)支架共培養并種植在成兔皮下,體內培養8wk發現新生軟骨外觀及組織學特征良好。研究者認為軟骨微環境在MSCs成軟骨分化及體內軟骨形成中具有重要作用,軟骨細胞能有效地誘導MSCs向軟骨細胞分化并促進MSCs體內軟骨形成[21]。Zhou等[22]建立了體內軟骨形成生態位，以控制外源性MSCs的分化方向。他們證實豬ACs分泌多種可溶性因子，并形成軟骨生態位，誘導bMSCs穩定的成軟骨。該共培養體系有望修復鼻、耳等缺乏軟骨形成生態位的皮下軟骨組織損傷。在大鼠[23]和兔子[24]的軟骨缺損中，靜電紡絲PCL[23]和光交聯PCL-peg-PCL[24]等支架共培養體系具有很大的軟骨再生潛力。Elbadry Mahmoud等[12]建立股骨內側髁骨軟骨模型，發現sMSCs/bMSCs多種干細胞共培養的模式能更好的填充骨軟骨缺陷，表面更加光整。

耳再造方面，Li等建立了軟骨細胞板來包裹骨髓基質細胞工程軟骨，將其植入裸鼠皮下[25]。該方法為維持軟骨表型提供了一種成軟骨環境。值得注意的是，小耳畸形軟骨細胞具有更強的增殖能力和軟骨誘導能力，為共培養MSCs創造了一個良好的軟骨形成生態位[13]。盡管有體內AuCs和ADSCs（1:10）共培養的報道[17]，但是該研究所產生軟骨成分（纖維軟骨還是彈力軟骨）不清，其分子機制也未得到揭示，且體內觀察時間較短（4周）。與之相比，Mieke M.Pleumeekers將AuCs和bMSCs在裸鼠體內皮下植入8周，首次成功構建了基于干細胞來源的人耳工程軟骨組織[3]。然而，該皮下埋植后的軟骨彈性模量約為人耳或鼻軟骨的1%，未來可能需要機械結構穩定的支架輔助；且細胞數量和密度與臨床所需尚存在明顯差距[3]。這些來自體內研究的進展為今后臨床前或臨床試驗提供了充分的理論基礎。未來的研究在降低耳廓軟骨來源細胞比例的同時，應進一步加強共培養工程軟骨組織的機械特性。靜電紡絲PCL[23]和光交聯PCL-peg-PCL[24]等體系在構建耳廓軟骨膜，分隔軟骨核心和外被皮膚方面具有廣闊的發展前景。對耳廓軟骨共培養體內研究的機制不充分，關節軟骨中常用的間接共培養系統[26,27]可能是揭示耳廓軟骨共培養分子機制的有力策略。

3 間接共培養體系與軟骨再生

間接共培養體系使用半透膜在物理空間中把不同的共培養細胞分隔開來，使得細胞可以通過釋放各自的可溶性因子進行交流?？扇苄砸蜃訉毎δ苡酗@著影響，特別是對MSCs等具有較高可塑性的細胞類型。此外，間接共培養具有一定的優勢，能夠從形態上清晰的觀察MSCs與軟骨細胞在共培養中各自的大體形態及相應的ECM分泌變化，且有研究表明間接共培養體系可比直接共培養表達更多的蛋白多糖及膠原物質[28]。間接共培養體系也分為單層方式和三維方式。旁分泌等營養效應的具體誘導作用機制，可以使用間接共培養的方式進一步研究。

3.1 間接共培養體系中MSCs對軟骨細胞的作用

在共培養體系中，軟骨細胞的增殖或者再分化是由MSCs分泌的營養因子刺激的，而ECM主要來自于軟骨細胞而不是軟骨性MSCs。MSCs具有營養、抗炎和免疫抑制作用，通過調節T和B細胞誘導抗炎癥因子的表達，如白細胞介素10(IL-10)、IL-1受體拮抗劑(IL-1 RA)或前列腺素E2(PGE2)。間接共培養人牙髓干細胞(DPSCs)和人ACs，DPSCs通過STAT1途徑抑制金屬蛋白酶3（MMP3）和MMP13的表達，證實局部注射DPSCs可能對進行性顳下頜關節關節炎的治療作用[29]。ADSCs可通過誘導滑膜分泌具有軟骨保護作用的液體因子(如軟骨細胞增殖和軟骨基質保護)來抑制軟骨退變的進展[30]。Karperien等的一項實驗表明，不同來源的MSCs和軟骨細胞共培養時，MSCs展示出相似的營養促進效果，提示共培養對培養條件和MSCs的來源依賴性不高，有一定的獨立性[28]。然而，Acharya等[31]的研究表明，人ACs或鼻中隔軟骨細胞與人bMSCs或ADSCs在共培養體系中具有協同作用。盡管大多數MSCs已經凋亡，MSCs在不去分化的情況下促進軟骨細胞的增殖，而剩余的由軟骨細胞誘導的MSCs則表現出較強的成軟骨能力。在間接共培養體系中，MSCs還通過旁分泌信號抑制軟骨細胞分化[32]。Zhihua Han等[26]在間接共培養體系中，結合微陣列分析和生物信息學技術，首次全面鑒定了與ASCs共培養改變的退化性髓核軟骨細胞的差異表達lncRNA和mRNA，揭示了基因表達調控模式。目前，尚未見耳廓軟骨細胞間接共培養的研究，上述共培養的實驗提示共培養存在一定的依賴細胞來源的可能，但是還有爭議。通過間接共培養研究與耳廓軟骨細胞產生協同效應的MSCs，以及借鑒生物信息學技術等深入挖掘其特殊的營養效應機制和基因調節網絡，值得進一步探討。

3.2 間接共培養體系中軟骨細胞對MSCs的作用

大多數實驗顯示間接共培養中軟骨細胞誘導MSCs向軟骨細胞分化。在有軟骨細胞的Transwell系統中培養的人胚胎干細胞表達II型膠原，GAG產生增加[33]。軟骨細胞的生長因子可以誘導條件培養基（CCM）中的bMSCs成軟骨分化，效果甚至高于TGF-β3 標準培養基[34]。Qi Zhang等[35]體外建立Transwell體系接種ADSCs和軟骨細胞。發現ADSCs和軟骨細胞在共培養組中比在單培養組中遷移更少，而遷移距離是判斷細胞去分化程度的重要指標之一[20]。共培養組中絲狀偽足的減弱抑制了遷移，下調的MMP-2降低了ECM重塑，上調的Vinculin抑制細胞遷移。Notch信號通路可能參與了這一過程。

然而，軟骨細胞來源的因子并不總是促進軟骨形成或者維持表型。常氧條件下鼻軟骨細胞可產生炎性因子，彌散通過Transwell誘導肥大軟骨形成，MMP13升高，降低GAG基質和ACAN基因表達，降低共培養工程軟骨的成軟骨潛能。該實驗從一個側面反應出共培養體系和其它調節因素聯合的重要作用。低氧是促進軟骨分化的常規條件之一，在常氧等不合適條件下，即使共培養也不足以改變軟骨細胞去分化的趨勢。

4 共培養體系和其它轉化因素的綜合應用

有研究嘗試在共培養體系與其他條件同時作用，進一步促進軟骨細胞增殖轉化。將KGN加入到Col-Tgel水凝膠中可為BMSCs和/或ACs的軟骨再生提供適宜的微環境[36]。對共培養的bMSCs和ACs進行周期性正弦動態力學刺激，既提高了軟骨細胞的增殖能力，又改善了共培養細胞的軟骨表型[37]。TGF-β家族BMP-SMAD信號轉導是細胞定向分化的關鍵事件之一。Chen,M.J.等[38]建立數學模型描述共培養中TGF-β的作用，發現內源性TGF-β作用下，如果軟骨細胞的初始比例超過一個臨界值，就會誘導完全軟骨形成；外源性TGF-β作用下，則存在一個關鍵濃度點，是誘導MSCs完全軟骨形成的必要條件。

5 結論與啟示

耳軟骨工程種子細胞的數量有限和去分化等問題，限制了生物工程技術在耳廓軟骨再造的進一步發展。共培養體系有助于解決單一培養在軟骨組織工程中遇到的諸多問題。然而，潛在的機制仍然不清楚。共培養研究大部分都是關于干細胞與ACs的共培養，耳軟骨細胞的共培養研究較少。此外，干細胞和軟骨細胞常常在直接共培養環境中混合在一起，從而混淆了兩種不同細胞群間基質形成的貢獻。耳廓軟骨共培養分子機制可以借鑒關節軟骨中常用的間接共培養系統，以及基因微陣列和生物信息學等方法得到揭示。1:1的MSCs、3:7的ADSCs與軟骨細胞共培養的比例相對多見，但是對于殘耳來源的組織工程耳，可能軟骨種子細胞來源仍然有限，部分無耳畸形的患兒甚至可能考慮從健側獲取種子細胞，進一步限制了軟骨工程細胞的可用數量，因此需要進一步降低共培養中AuCs的比例。成軟骨能力更強且所需軟骨細胞比例更少的uMSCs可能是一種新的選擇，兩種以上的干細胞共培養的方案[11]也值得嘗試。共培養系統與其它條件的綜合使用也是軟骨工程的發展方向之一。Chen,M.J.[38]等的模型建立不但揭示了TGF-β家族在軟骨細胞共培養中的數學關系，也有望揭示軟骨細胞和各種MSCs的比例問題，進一步運用在軟骨細胞共培養誘導技術中。期待在耳廓軟骨組織工程研究中進一步探索共培養與其它因素的綜合應用。