Toll樣受體4及骨形成蛋白2表達在慢性阻塞性肺疾病患者血管重塑中的作用研究

張馨文，叢金鵬，董 蕾，于文成

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以氣流受限不完全可逆、呈進行性發展為特征，可以預防和治療的疾病[1-2]，常表現為氣道、肺實質及血管的慢性炎癥。其中肺血管的慢性炎癥及其所引起的肺血管重塑被認為是COPD的基本病理特征之一，但其機制尚待闡明。近年有關Toll樣受體4(TLR-4)及骨形成蛋白2(BMP-2)在肺血管重塑中可能具有重要作用的報道多數來自動物模型[3-5]，但二者在COPD患者體內表達情況及其作用的研究尚未見報道。本研究以COPD肺組織標本為材料，對其中TLR-4、BMP-2及平滑肌細胞增殖細胞核抗原(PCNA)的表達進行了檢測，并將其表達水平與肺血管重塑進行了相關性分析，為COPD的防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源與處理 肺組織標本取自青島大學醫學院附屬醫院胸外科2012年7月—2013年7月住院需要手術治療的50例男性高分化肺鱗癌患者。根據是否患有COPD將患者分為COPD組和對照組，各25例。COPD診斷依據慢性阻塞性肺疾病診治標準[1]，且COPD患者均處于穩定期，無其他肺部及其他系統性疾病。兩組患者年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)；術前肺功能測定，COPD組第1秒用力呼氣末容積占預計值百分比(FEV1%)、第1秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 兩組患者年齡和肺功能比較

注：FEV1%=第1秒用力呼氣末容積占預計值百分比；FEV1/FVC=第1秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比

1.2 標本處理 手術切除患者肺葉后，取遠離腫瘤部位5 cm以上未見浸潤的正常外周肺組織，石蠟包埋切片。所有標本的使用符合知情同意原則。

1.3 形態學觀察 切片經HE染色，光學顯微鏡下觀察肺動脈形態結構變化，選擇直徑為100～500 μm的動脈，半定量評價動脈壁及周圍炎性細胞浸潤程度。炎癥評分標準：無炎性細胞浸潤為0分；少許炎性細胞浸潤為1分；浸潤的炎性細胞較多但分布不均勻為2分；炎性細胞浸潤較多，分布均勻，但不聚集成團為3分；大量炎性細胞浸潤并聚集成團為4分。隨機選取橫斷面較圓且結構完整的5條肺小動脈，Dotslide取像并測量肺小動脈管壁內外徑及管壁厚度與管壁面積，計算管壁厚度占外徑百分比(WT%)和血管壁橫斷面積占血管總面積百分比(WA%)，取其平均值記為各組的血管重塑指標。

1.4 免疫組化染色法檢測TLR-4、BMP-2、PCNA 采用PV-6000二步法檢測TLR-4、BMP-2、PCNA，嚴格按照試劑盒(購自美國3M公司)說明書進行操作。每張切片在400倍視野下隨機采集5條直徑100～500 μm肺小動脈，請兩位有經驗的病理專業醫師觀察同一血管壁橫斷面，計數并取其均值。TLR-4、BMP-2以細胞質呈棕黃色顆粒改變為陽性表達，觀察計數肺動脈平滑肌細胞中TLR-4、BMP-2陽性細胞數占總平滑肌細胞數的百分比計為TLR-4、BMP-2表達水平；PCNA陽性反應定位于細胞核，出現棕黃色顆粒則為增殖細胞，觀察計數PCNA陽性細胞占總平滑肌細胞數的百分比計為PCNA表達水平。

2 結果

2.1 兩組肺血管炎性細胞浸潤及重塑程度比較 光學顯微鏡下COPD組肺血管管壁及周圍有大量單核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，肺血管管壁明顯增厚，管腔狹窄，細胞間質增多，出現肺血管重塑現象。COPD組患者炎癥評分、WT%、WA%均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

Table2 Comparison of inflammatory infiltration degree and vascular remodeling degree between the two groups

組別例數炎癥評分(分)WT%WA%對照組250 4±0 614 2±1 721 6±1 8COPD組251 6±0 827 8±3 435 7±3 0t值-6 278-17 624-19 942P值<0 01<0 01<0 01

注：WT%=管壁厚度占外徑百分比，WA%=血管壁橫斷面積占血管總面積百分比

2.2 兩組TLR-4、BMP-2及PCNA陽性表達水平比較 COPD組患者肺動脈血管平滑肌細胞TLR-4、BMP-2、PCNA表達水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

2.3 COPD組TLR-4、BMP-2及PCNA表達水平與血管重塑相關性 COPD組患者肺動脈平滑肌細胞TLR-4、BMP-2水平與炎癥評分、WT%、WA%及PCNA水平均呈正相關，PCNA水平與WT%、WA%、炎癥評分均呈正相關(P<0.05,見表4)。

Table3 Comparison of the levels of expression of TLR-4，BMP-2 and PCNA between the two groups

組別例數TLR-4BMP-2PCNA對照組25 9 5±9 4 5 0±4 6 7 8±5 0 COPD組2529 3±16 030 9±21 328 3±12 7t值-5 344-6 099-7 522P值<0 01<0 01<0 01

注：TLR-4=Toll樣受體4，BMP-2=骨形成蛋白2，PCNA=增殖細胞核抗原

表4 COPD組TLR-4、BMP-2及PCNA表達水平與WT%、WA%、PCNA及炎癥評分的相關性(r值)

Table4 Correlation between the expression level of TLR-4,BMP-2，PCNA and WT%,WA%,PCNA，inflammation score in COPD group

TLR-4BMP-2PCNAWT%0 476?0 642?0 709?WA%0 622?0 550?0 713?PCNA0 322?0 558?-炎癥評分0 445?0 520?0 385?

注：*P<0.05；-為無此項

3 討論

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是一類天然免疫受體，可激活天然免疫、誘導獲得性免疫，其在COPD發病機制中的作用日益受到關注[6]。TLR-4是人類發現的第一個TLR相關蛋白，其主要識別革蘭陰性桿菌的內毒素/脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)[7]。LPS進入肺臟后與TLR-4結合，產生多種促炎細胞因子的合成和釋放，引起肺部炎性反應[8]。孟瑩等[3]通過動物實驗發現，在煙熏和脂多糖聯合煙熏所致肺部炎癥損傷大鼠中TLR-4的表達量較對照組明顯增加，指出TLR-4可能參與了大鼠肺部炎性反應及COPD的形成。BMP屬于轉化生長因子β(TGF-β)超家族的一員[9]，參與調節多種細胞增殖、分化、組織修復、炎性反應、血管形成等作用[10]。BMP-2是這一家族的主要成員，其與受體結合后能調節細胞的增殖和凋亡[11]。楊瑩等[5]實驗表明，慢性低氧可引起大鼠肺小動脈壁BMP-2表達的上調，證實BMP-2可能在低氧性肺血管重塑過程中發揮一定作用。

本研究表明，COPD組血管炎癥程度、血管重塑指標(WT%、WA%)明顯高于對照組，提示COPD血管存在炎性反應，后者可能直接或間接誘導血管重塑的發生；而肺動脈平滑肌細胞TLR-4的表達與對照組相比明顯提高，且其表達水平與血管炎癥程度、血管重塑指標呈正相關，表明TLR-4參與了血管炎癥的發生，炎癥進一步引起了血管重塑，且與PCNA表達呈正相關。這一研究結果提示，TLR-4可能通過誘導肺動脈平滑肌的增殖，平滑肌的增生引起血管壁的增厚，管腔狹窄，引起肺血管重塑，繼而導致肺動脈高壓的產生。

近年來的研究發現，家族性肺動脈高壓及部分特發性肺動脈高壓的患者存在BMPR-Ⅱ的基因突變，由于BMP與BMPR-Ⅱ、BMPR-Ⅰ復合物形成缺陷，致使肺動脈平滑肌細胞增殖效應增加，而凋亡作用減弱[12-13]。目前尚未有實驗證實BMPR-Ⅱ基因突變與COPD引起的低氧性肺動脈高壓有關。本研究結果顯示，COPD組肺動脈平滑肌細胞BMP-2表達較對照組明顯升高，且與反映肺小動脈平滑肌細胞增殖的PCNA、與反映肺血管重塑程度的指標WT%、WA%及炎癥程度呈正相關。其機制可能在于，COPD患者長期的慢性低氧可引起血管BMP-2的上調，致使肺動脈平滑肌細胞增殖，并促進炎性反應的發生，繼而造成肺血管重塑的形成，從而引起低氧性肺動脈高壓，這與家族性肺動脈高壓及部分特發性肺動脈高壓產生的機制不同。

總之，COPD患者肺血管平滑肌中TLR-4及BMP-2的表達水平增加，均能夠從促進炎性反應及血管平滑肌細胞的增殖兩個途徑引起COPD患者血管重塑，進而促進肺動脈高壓的形成。因此，及時檢測TLR-4及BMP-2的表達水平，可能有助于COPD的早期診斷及其病情嚴重程度的觀察，這對防治COPD的進展、改善其預后等具有一定臨床意義。但本研究在應用到臨床患者的治療中如發展靶向治療的方法，具有一定的局限性，故今后還有待進一步研究。

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