Nutlin-3a誘導p73α對p53突變型結腸癌細胞的作用及其機制研究

鄔黎青，詹 媛，王 莉，陳 玲，陳小青，楊 洋，高 歌，郝 華

Nutlin-3a是近幾年發現的MDM2小分子拮抗劑，能結合到MDM2上的 p53位點，阻止MDM2與p53結合，穩定內源性野生型p53并激活p53通路[1-4]，抑制細胞生長，引起細胞凋亡。在p53缺失或p53基因突變的癌細胞中，Nutlin-3a能阻止MDM2與p73α結合，增加內源性p73α的轉錄活性[5-6]，同時p73α能激活p53應答基因，從而抑制細胞生長，引起細胞凋亡。以前認為低量的p53引起細胞靜止，而高量的p53導致細胞老化或凋亡[7]。然而2010年有研究顯示，低濃度Nutlin-3a誘導p53低表達，導致細胞老化；而高濃度Nutlin-3a誘導p53高表達，導致癌細胞死亡(凋亡及有絲分裂死亡)的同時，又把部分癌細胞阻滯在靜止期，這些靜止期的細胞撤藥后能恢復進入細胞周期，進行生長增殖[8-9],這限制了Nutlin-3a的治療作用。腫瘤中p53基因突變很常見，而p73α基因突變卻罕見[10]。對于p53基因突變的腫瘤，Nutlin-3a不能誘導其內源性p53的產生，但可通過誘導p73α來達到治療腫瘤的目的。 Nutlin-3a抑制含野生型p53基因的結腸癌細胞生長的研究已有發表[11]，但Nutlin-3a對p53基因突變的結腸癌細胞的作用尚未見報道。 本課題研究Nutlin-3a對p53突變型結腸癌細胞株Coca-2的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 試劑、細胞株和細胞培養 Nutlin-3a〔Sigma，溶解于二甲基亞砜(DMSO)，10 mmol/L小試劑瓶分裝，-20 ℃保存〕； DMEM高糖液體培養基及胎牛血清購自Hyclone公司；p73α及p21抗體購自美國Abcom公司； MTT試劑盒、β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色試劑盒購自碧云天生物技術公司。人體結腸癌細胞株Caco-2(上海中科院細胞庫)，用10%胎牛血清DMEM培養基培養于5%二氧化碳(CO2)、37 ℃潮濕環境中。

1.2 MTT實驗 收集并調整細胞懸液濃度至合適濃度，每孔加入200 μl接種至96孔板，培養24 h后吸棄上清，實驗設8組(對照組及不同濃度Nutlin-3a組)，每組設6個復孔，分別加入0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μmol/L的Nutlin-3a培養液200 μl，分別培養24、48、72 h。避光條件下進行如下操作：棄去舊培養基，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2遍，加入新培養基200 μl后，每孔再加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，細胞培養箱中繼續孵育4 h，棄去舊培養基，每孔加入150 μl DMSO,使結晶充分溶解。在酶聯免疫檢測儀于570 mm波長處測量各孔的吸光度(OD570 nm)。根據吸光度計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率=(1-實驗組OD570 nm/對照組OD570 nm)×100%。

1.3 Western blotting法 將Caco-2細胞接種于35 mm培養皿(調整細胞數為3×105個/皿)；24 h后用不同濃度Nutlin-3a培養液培養Caco-2細胞；72 h后倒掉培養液，Western blotting法檢測p73α及p21蛋白表達。最后行光密度分析：通過Gel．Pro analyzer圖像分析系統讀取目的條帶在X光膠片測得的光密度值，以各組β-actin條帶的掃描值標化其蛋白表達量。

1.4 衰老相關β-Gal染色 β-Gal聚集在老化細胞的溶酶體中，在老化細胞中高表達，被作為老化細胞的生物標志物。β-Gal染色是以X-Gal為底物，X-Gal經糖β-Gal切割后生成藍綠色的沉積產物，該產物在顯微鏡下容易被觀察到而用來探測和鑒別衰老細胞。將Caco-2細胞接種于35 mm培養皿；24 h后用不同濃度Nutlin-3a培養液培養Caco-2細胞；72 h后按照衰老相關β-Gal染色試劑盒說明書進行β-Gal染色實驗。

1.5 細胞集落形成分析 將Caco-2細胞接種于35 mm培養皿(調整細胞數為3×105個/皿)；24 h后用不同濃度Nutlin-3a培養液培養Caco-2細胞；72 h后用PBS清洗細胞3次，然后用新鮮培養基培養細胞。72 h后，顯微鏡下觀察細胞是否增生，細胞微集落是否形成；繼續用新鮮培養基培養72 h，PBS清洗后，進行結晶紫染色，顯微鏡下觀察細胞集落(>50個細胞/集落)的形成。

2 結果

2.1 對照組及不同濃度Nutlin-3a組不同時間吸光度及細胞生長抑制率比較 對照組及不同濃度Nutlin-3a組不同時間吸光度及細胞生長抑制率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；Nutlin-3a濃度與處理時間存在交互作用(P<0.05)；對照組及不同濃度Nutlin-3a組吸光度及細胞生長抑制率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；不同時間間差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table1 Comparison of absorbance value and cell inhibition rate between control group and Nutlin-3a groups with different concentrations and among different times

組別吸光度24h 48h 72h細胞生長抑制率(%)24h 48h 72h對照組0 72±0 081 15±0 060 76±0 05---2 5μmol/L組0 51±0 030 71±0 050 59±0 0328 61±1 4938 11±0 9738 46±1 305 0μmol/L組0 42±0 140 69±0 090 45±0 0841 84±0 2240 29±1 3253 01±1 0610 0μmol/L組0 37±0 100 35±0 130 18±0 0151 27±1 3169 19±1 5281 08±1 0220 0μmol/L組0 26±0 040 18±0 110 14±0 0363 73±1 0184 07±1 8485 55±1 3440 0μmol/L組0 17±0 030 13±0 040 08±0 0177 02±0 7188 68±0 5391 68±0 8660 0μmol/L組0 12±0 060 09±0 050 07±0 0282 87±0 3291 99±0 8695 01±0 6280 0μmol/L組0 10±0 020 06±0 010 05±0 0185 65±0 6594 68±0 2097 40±0 51F值F交互=4 65，F組間=21 29，F時間=68 59F交互=8 92，F組間=19 67，F時間=20 49P值P交互=0 026，P組間<0 001，P時間<0 001P交互<0 001，P組間<0 001，P時間<0 001

注：-為無此項

2.2 對照組及不同濃度 Nutlin-3a組p73α及p21蛋白表達比較 對照組及不同濃度 Nutlin-3a組p73α及p21蛋白表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中2.5 μmol/L組、5.0 μmol/L組、10.0 μmol/L組、20.0 μmol/L組、40.0 μmol/L組、60.0 μmol/L組、80.0 μmol/L組p73α蛋白表達高于對照組，10.0 μmol/L組、20.0 μmol/L組、40.0 μmol/L組、60.0 μmol/L組、80.0 μmol/L組p73α蛋白表達高于2.5 μmol/L組，20.0 μmol/L組、40.0 μmol/L組、60.0 μmol/L組、80.0 μmol/L組p73α蛋白表達高于5.0 μmol/L組，60.0 μmol/L組和80.0 μmol/L組p73α蛋白表達高于10.0 μmol/L組，80.0 μmol/L組p73α蛋白表達高于20.0 μmol/L組和40.0 μmol/L組，差異均有統計學意義(P<0.05)；40.0 μmol/L組、60.0 μmol/L組、80.0 μmol/L組p21蛋白表達高于對照組，60.0 μmol/L組和80.0 μmol/L組p21蛋白表達高于2.5 μmol/L組和5.0 μmol/L組，80.0 μmol/L組p21蛋白表達高于10.0 μmol/L組和20.0 μmol/L組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2、圖1)。

Table2 Comparison of levels of p73α and p21 protein between control group and Nutlin-3a groups with different concentrations

組別p73αp21對照組1 23±0 111 02±0 082 5μmol/L組2 75±0 26?1 75±0 465 0μmol/L組3 15±0 35?1 86±0 6110 0μmol/L組4 36±0 16?△2 44±0 3720 0μmol/L組4 83±0 34?△▲2 56±0 6840 0μmol/L組5 06±0 46?△▲3 43±0 56?60 0μmol/L組5 56±0 63?△▲☆4 09±0 46?△▲80 0μmol/L組6 56±0 35?△▲☆★●4 65±0 51?△▲☆★F值65 7618 72P值<0 001<0 001

注：與對照組比較，*P<0.05；與2.5 μmol/L組比較，△P<0.05；與5.0 μmol/L組比較，▲P<0.05；與10.0μmol/L組比較，☆P<0.05；與20.0 μmol/L組比較，★P<0.05；與40.0 μmol/L組比較，●P<0.05

圖1 對照組及不同濃度 Nutlin-3a組p73α及p21蛋白表達

Figure1 The expression of P73α and P21 protein in control group and Nutlin-3a groups with different concentrations

2.3 β-Gal染色結果 Nutlin-3a濃度為2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L時可導致Caco-2細胞老化，細胞呈現大而扁平的老化形態學改變，老化細胞β-Gal染色呈藍綠色；當Nutlin-3a濃度為40.0、60.0、80.0 μmol/L時，大量細胞壞死，殘存的細胞體積變小，呈現出細胞靜止的形態學改變，衰老相關β-Gal染色陰性(見圖2)。

2.4 細胞集落形成分析結果 對照組及不同濃度Nutlin-3a組不同時間Caco-2細胞數量比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；Nutlin-3a濃度與處理時間存在交互作用(P<0.05)；對照組及不同濃度Nutlin-3a組Caco-2細胞數量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；不同時間間差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

Table3 Comparison of Caco-2 cell count of control group and Nutlin-3a groups with different concentrations in different time points

組別處理72h撤藥72h撤藥144h對照組172324±4361189357±3461242184±38152 5μmol/L組144578±2461164553±2876198672±29435 0μmol/L組112645±3618125678±3176126646±196310 0μmol/L組78642± 56887562± 61190432± 53420 0μmol/L組45614± 24951468± 29169623± 34940 0μmol/L組15568± 34955646± 315106158± 38160 0μmol/L組11837± 24852424± 169101238± 21780 0μmol/L組10229± 17948123± 23497623± 496F值F交互=18 10，F組間=4 26，F時間=5 78P值P交互<0 001，P組間<0 001，P時間=0 017

圖2 對照組及不同濃度 Nutlin-3a組β-Gal染色結果

3 討論

研究表明Nutlin-3a在含野生型p53的各種癌癥治療中有效,而在突變型p53中無效[12]。Nutlin-3a通過結合到MDM2的 p53位點，阻斷MDM2與p53結合，抑制MDM2對p53的降解，穩定內源性野生型p53并激活p53通路[1-4]，抑制細胞生長并引起細胞凋亡。50%以上的腫瘤中p53基因發生突變，而p73α基因突變卻罕見。MDM2與p73α結合后，不能降解p73α，但能抑制p73α的轉錄活性，使細胞內p73蛋白含量減少[13]。 p73α結合在MDM2的N-端疏水基團上，這也是Nutlin-3a的結合部位。Nutlin-3a結合此部位后，阻斷了p73α與MDM2的結合，從而解除MDM2對p73α的抑制作用。本研究結果顯示，含突變型p53基因的結腸癌Caco-2細胞經Nutlin-3a處理后，Nutlin-3a濃度增高，p73α及p21蛋白表達也有所增加。p73α基因是p53基因的家族成員，具有與p53相似的功能，在抑制腫瘤的發生中有重要作用。人p73 基因有α、β、γ、δ和 ε等多個同源異構體，是由于p73轉錄時不同地剪接及利用不同的啟動子進行轉錄造成的，其不同在于N-及C-末端。p73α是全長p73，由 636個氨基酸組成，其C-末端的142個氨基酸是其獨有的。p73α基因的結構類似于p53基因，具有p53基因相似的功能基團及相似的生物活性[14]，能激活p53應答基因如p21、Bax、Puma和Noxa等而抑制細胞生長，引起細胞凋亡[15-16]。其中，p21是強有力的周期蛋白依賴性激酶抑制劑，能使細胞停滯在G1期，不進入S期，從而抑制細胞增生。p73α的增高會引起凋亡相關蛋白Bax、Puma及Noxa的增高，故細胞凋亡增加，殘存的細胞減少。此外，p21亦能介導細胞老化，在許多細胞中，過度表達p21均能引起細胞老化，而敲除p21則能延緩細胞老化。細胞老化是指細胞生長發生G1/S期阻滯，不可逆地喪失增殖潛能、具有大而扁平的形態特征、表達特征性生物標記β-Gal。

本研究結果顯示，2.5～20.0 μmol/L的Nutlin-3a誘導p21蛋白表達量較低，引起較多細胞老化，而40.0～80.0 μmol/L的Nutlin-3a所誘導的p21蛋白表達量較高，使殘存的細胞呈靜止狀態，這似乎與上述p21的作用相反。其實，除p21外，細胞的狀態受多種蛋白的影響。細胞對靜止期及老化期的選擇還部分取決于絲/蘇氨酸激酶mTOR(mammalian target of rapamycin)的活性。當mTOR活性被p53及p73靶基因TSC2(tuberous sclerosis 2)抑制時，細胞進入靜止期；當mTOR活性未被抑制或未被完全抑制時，細胞進入老化期。高濃度Nutlin-3a誘導較高量的p53通過激活其靶基因TSC2而抑制mTOR活性，使細胞進入靜止期[17]。TSC2為p73的靶基因，盡管本研究未檢測TSC2的表達(將在下一步的實驗中檢測)，但可推測2.5～20.0 μmol/L的Nutlin-3a誘導p73α蛋白表達量較低，其靶基因TSC2的蛋白表達量也較低，不能完全抑制mTOR的活性，細胞進入老化期。40.0～80.0 μmol/L的Nutlin-3a誘導p73α蛋白表達量較高，產生的TSC2較高，完全抑制mTOR活性，細胞進入靜止期。靜止期的細胞在藥物撤除后恢復增生能力，使腫瘤復發。

綜上所述，Nutlin-3a通過阻斷MDM2與p73α的結合，解除MDM2對p73α的抑制作用，使p53基因突變型Caco-2結腸癌細胞中的p73α活性增強，以致p73α及其下游靶基因p21、Bax、Puma等的蛋白表達增強，而抑制癌細胞生長、引起細胞凋亡，達到治療腫瘤的目的。高濃度的Nutlin-3a引起腫瘤細胞顯著誘導死亡，但因誘導大量的 TSC2完全抑制mTOR的活性，使殘存的癌細胞處于靜止期，藥物撤除后恢復生長，腫瘤復發。因此，使用Nutlin-3a治療腫瘤時，考慮其對腫瘤細胞抑制及殺傷作用的同時，應當考慮到其對殘存細胞細胞周期的影響，只有在使用適當的藥物濃度避免靜止期細胞殘存時才能對腫瘤起到根治作用。本研究表明在體外2.5～20.0 μmol/L的Nutlin-3a對p53突變型結腸癌的治療作用最為理想。

本課題人員貢獻：鄔黎青與詹媛共同設計了本研究并共同完成Western blotting部分的實驗及整理結果并撰寫論文，為本研究做了等同的貢獻。王莉及陳玲共同完成了細胞培養及MTT實驗以及所有的統計學分析。陳小青及楊洋完成了衰老相關β-Gal染色實驗。高歌及郝華完成了細胞集落形成實驗。

本文創新點：

(1)檢測Nutlin-3a對p53基因突變的結腸癌細胞株Caco-2的作用。

(2)發現2.5～20.0 μmol/L的Nutlin-3a能明顯抑制Caco-2細胞，撤藥后殘存的細胞再生不明顯；殘存的細胞處于老化期；這個濃度范圍的Nutlin-3a是體外治療p53基因突變的結腸癌的最佳濃度。

1 Vassilev LT,Vu BT,Graves B,et al.In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2[J].Science,2004,303(5659):844-848.

2 Lane DP.Cancer p53,guardian of the genome[J].Nature,1992,358(6381):15-16.

3 Vousden KH.Apoptosis.p53 and PUMA:a deadly duo[J].Science,2005,309(5741):1685-1686.

4 Slee EA,O′Connor DJ,Lu X.To die or not to die:how does p53 decide?[J].Oncogene,2004,23(16):2809-2818.

5 Lau LM,Nugent JK,Zhao X,et al.HDM2 antagonist Nutlin-3 disrupts p73-HDM2 binding and enhances p73 function[J].Oncogene,2008,27(7):997-1003.

6 Ray RM,Bhattacharya S,Johnson LR.MDM2 inhibition induces apoptosis in p53 deficient human colon cancer cells by activating p73-and E2F1-mediated expression of PUMA and Siva-1[J].Apoptosis,2011,16(1):35-44.

7 Santoro R,Blandino G.p53:The pivot between cell cycle arrest and senescence[J].Cell Cycle，2010,9(21):4262-4263.

8 Leontieva OV,Gudkov AV,Blaqosklonny MV.Weak p53 permits senescence during cell cycle arrest[J].Cell Cycle,2010,9(21):4323-4327.

9 Korotchkina LG,Leontieva OV,Bukreeva EI,et al.The choice between p53-induced senescence and quiescence is determined in part by the mTOR pathway[J].Aging,2010,2(6):344-352.

10 Olivier M,Hollstein M,Hainaut P.TP53 mutations in human cancers:origins,consequences,and clinical use[J].Cold Spring Harb Perspect Biol，2010,2(1):a001008.

11 Janouskova H,Ray AM,Noulet F,et al.Activation of p53 pathway by Nutlin-3a inhibits the expression of the therapeutic target a5 integrin in colon cancer cells[J].Cancer Lett,2013,336(2):307-318.

12 Wang J,Zheng T,Chen X,et al.MDM2 antagonist can inhibit tumor growth in hepatocellular carcinoma with different types of p53 in vitro[J].J Gastroenterol Hepatol,2011,26(2):371-377.

13 Bálint E,Bates S,Vousden KH.MDM2 binds p73 alpha without targeting degradation[J].Oncogene,1999,18(27):3923-3929.

14 Shangary S,Wang S.Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function:a novel approach for cancer therapy[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，2009,49:223-241.

15 Tabe Y,Sebasigari D,Jin L,et al.MDM2 antagonist nutlin-3 displays antiproliferative and proapoptotic activity in mantle cell lymphoma[J].Clin Cancer Res，2009，15(3):933-942.

16 Zheng T,Wang J,Song X,et al.Nutlin-3 cooperates with doxorubicin to induce apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells through p53 or p73 signaling pathways[J].J Cancer Res Clin Oncol,2010,136(10):1597-1604.

17 Korotchkina LG,Leontieva OV,Bukreeva EI,et al.The choice between p53-induced senescence and quiescence is determined in part by the mTOR pathway[J].Aging，2010,2(6):344-352.