磷酸肌酸鈉對阿霉素所致心肌損傷大鼠急性期心肌組織連接蛋白43表達的影響

趙 強 周曉敏 辛 晴 趙 明*

（內蒙古通遼市內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古 通遼 028000）

磷酸肌酸鈉對阿霉素所致心肌損傷大鼠急性期心肌組織連接蛋白43表達的影響

趙 強 周曉敏 辛 晴 趙 明*

（內蒙古通遼市內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古 通遼 028000）

目的探討磷酸肌酸鈉對阿霉素所致心肌炎大鼠急性期心肌組織連接蛋白43（Cx43）表達的影響，探討磷酸肌酸鈉對阿霉素所致心肌炎并發心律失常發揮作用的機制。方法60只雄性SD大鼠分為磷酸肌酸鈉干預組，阿霉素組和正常對照組，觀察大鼠的一般情況，第14天無痛苦處死全部大鼠并留取心臟。免疫組織化學法檢測Cx43蛋白水平表達，并進行定量分析。結果①阿霉素組大鼠心室肌組織炎癥病灶中變性、壞死周圍心肌細胞Cx43表達明顯減弱，甚至陰性，分布不規則，Cx43蛋白表達明顯低于對照組，差異有統計學意義（Ρ＜0.01）。②磷酸肌酸鈉組Cx43蛋白表達明顯高于模型組，差異有統計學意義（Ρ＜0.01）。結論阿霉素所致心肌損傷大鼠急性期心肌組織Cx43蛋白表達下降。磷酸肌酸鈉能明顯提高CVB心肌炎大鼠急性期心肌組織Cx43蛋白表達。

磷酸肌酸鈉；阿霉素；連接蛋白43

阿霉素（admiamycin，ADM）是一種廣譜高效蒽環類抗腫瘤藥物，在臨床應用廣泛，ADM與心肌細胞具有良好的親和力，而心肌細胞清除自由基的能力非常低，這就使ADM具有心臟毒性，也制約了其臨床應用范圍。ADM的心臟毒性主要作用是導致心功能降低以及產生各種心律失常，前者導致充心臟的血性心力衰竭，后者可以導致心臟的嚴重心律失常，甚至心源性猝死的發生?？p隙連接（gap junction，GJ）是相鄰細胞間的跨膜通道，允許大分子物質如離子及第二信使通過，成為相鄰細胞間物質交換及信號傳導最直接方式。連接蛋白43（connexin43，Cx43）是心室縫隙連接的主要構成成分，其分布及功能的改變對于縫隙連接的活性有重要影響[1-2]。磷酸肌酸通過對心肌細胞提供能量，防止其產生氧自由基，磷酸肌酸分子中所含有的高能磷酸鍵是細胞的重要能源[3]，磷酸肌酸阻止氧自由基對細胞的損害進而對抗對心肌細胞的損傷，磷酸肌酸鈉對Cx43的作用還未見報道。本實驗通過觀察磷酸肌酸鈉對ADM損傷大鼠心肌Cx43的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料：①實驗動物：SD大鼠，二級動物，由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供。②阿霉素由深圳萬樂藥業有限公司生產（批號為1206E4），注射用磷酸肌酸鈉由吉林英聯生物技術有限公司生產（批號為20100423）光學顯微鏡（Olympus，日本）和電子顯微鏡（H-600型，日本）。

1.2 阿霉素心肌損傷模型制備及實驗分組及實驗數據的采集和處理：健康6周齡雄性SD大鼠60只，適應性喂養后，隨機分為ADM組（每組20只），磷酸肌酸鈉組（每組20只）正常對照組（每組20只）；正常對照組：每2 d尾靜脈注射生理鹽水（10ml/kg ），共7次；阿霉素組：每2 d尾靜脈注射同容量ADM（2 mg/kg）共7次，磷酸肌酸鈉組（每2 d尾靜脈注射同容量ADM 2 mg/kg，共7次），第4天開始注射磷酸肌酸鈉每日200 mg/kg共10 d。

1.3 一般狀況觀察：觀察動物的精神狀況、血壓、飲食、活動、大小便、皮毛色澤形態及死亡數等。使用softron 智能無創血壓計BΡ-98A測量血壓，選擇與大鼠大大合適的鼠袋、鼠網，將大鼠頭部朝前，前端 朝上放入鼠袋，包緊大鼠臀部將鼠尾露出，將大鼠于38 ℃溫桶中預10 min，然后將加壓感應器正確置于尾根處，保持大鼠在安靜和清醒狀態下數秒后開始測量大鼠血壓，每只大鼠測量3次，記錄3次平均值為測量結果。

1.4 病理取材及切片制作：給藥后第14天，各組分別隨機取15只或剩余大鼠，脫頸椎處死后，立即沿腹中線剪開，在無菌狀態下將大鼠左肋剪開，暴露心臟，用眼科剪子將心臟取出，將上1/3心臟組織放入4%多聚甲醛溶液固定，乙醇脫水，石蠟包埋，連續切片，無菌取出心肌切片，脫蠟、二甲苯透明，進行HE常規染色，于光鏡下觀察病理變化。

1.5 免疫組織化學法檢測心室肌組織Cx43表達：將包埋組織的石蠟塊連續切成5 μm厚的薄片，嚴格按照試劑盒說明書操作過程進行操作，以ΡBS代替一抗設陰性對照，結果示陰性。分析方法：對心肌組織免疫組化染色圖片進行分析，每張組織切片的觀察均為隨機選取5個不重復的高倍視野（×400）觀察其改變，染色結果采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件測灰度值，灰度值越大陽性表達越低，灰度值越大陽性表達越高。

1.6 免疫沉淀：免疫沉淀法簡述為，蛋白濃度檢測采用考馬斯亮藍法，用瓊脂蛋白A沉淀非特異蛋白，再用兔抗鼠連接蛋白43抗體（北京博奧森生物公司產品）沉淀相應的蛋白，沉淀蛋白在100 ℃ 5 min變性，進行SDS-聚丙烯酰胺電泳、蛋白轉膜、封閉，加羊抗兔辣根過氧化物標記Ⅱ抗（北京博奧森生物公司產品）及化學發光試劑增強反應，X線片曝光顯影，凝膠成像系統分析光吸收，重復6次。

1.7 統計方法：本研究數據采用SΡSS13.0統計軟件包進行描述分析。所收集的數據用（）表示，組間均數比較采用t檢驗，變量間的相關分析采用直線相關分析。設定如果Ρ＜0.05時，則認為組間的差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠的一般情況及血壓變化：正常組的大鼠活動自如，未見異常表現，且無1例死亡。磷酸肌酸鈉治療組大鼠的一般情況好于ADM組，ADM大鼠在注射ADM后第4天，出現活動明顯減少，精神不佳，毛蜷縮無光澤，對外來刺激反應遲鈍，進食、進水量減少，大鼠于第8天出現死亡，共死亡3只大鼠，磷酸肌酸鈉治療組無大鼠死亡。正常組平均動脈壓無明顯變化（98±13）mm Hg，與正常組比較ADM組平均動脈壓降低有顯著差異性（79±16）mm Hg（Ρ＜0.01），磷酸肌酸鈉治療組與ADM組比較，平均動脈壓升高有統計學意義（88±19）mm Hg（Ρ＜0.05）。

2.2 病理學改變

2.2.1 心臟大體改變：正常組大鼠取出心臟，觀察外觀變化情況，未見明顯改變。ADM組的心臟改變非常明顯，觀察外觀可見每只大鼠心外膜均可見大面積的黃白色斑點以及心外膜下淤血。磷酸肌酸鈉組情況好于ADM對照組，大鼠心外膜偶見黃白色斑點，心外膜下無淤血。

2.2.2 光鏡觀察：大鼠部分心臟用10%的甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精伊紅染色，光鏡下觀察大鼠心肌的病理變化。HE染色結果：對照組大鼠心肌纖維排列整齊，結構清晰，細胞質豐富均勻，嗜酸性，被伊紅染成淡粉紅色，細胞核呈圓形或橢圓形，位于細胞中央，嗜堿性，被蘇木精染成藍色，核仁清晰，未見心肌纖維變性壞死等病理性改變。ADM組病理改變明顯，可見心肌纖維排列紊亂，部分心肌細胞質強嗜伊紅染成深粉紅色，細胞核固縮變性，核仁消失，心肌纖維間隔明顯增寬，間質明顯水腫，可見少量淋巴細胞浸潤。磷酸肌酸鈉治療組大鼠心臟出現輕微改變，心肌纖維排列尚可，結構清晰，細胞質豐富均勻被伊紅染成淡粉紅色，細胞核呈圓形或橢圓形，位于細胞中央被蘇木精染成藍色，核仁清晰，偶見心肌細胞質強嗜伊紅染成深粉紅色，細胞核固縮變性，核仁消失，心肌纖維間隔略增寬，間質輕度水腫，偶見淋巴細胞浸潤，見圖1、圖2。

圖1 ADM組心肌纖維排列紊亂可見淋巴細胞浸潤（HE×200）

圖2 磷酸肌酸鈉組心肌纖維排列尚可，結構清晰，偶見淋巴細胞浸潤（HE×200）

2.2.3 心室肌組織Cx43免疫組織化學：對照組心室肌組織Cx43陽性表達主要分布于心肌細胞縱軸方向，分布規則，灰度值為（115± 21）。ADM組的心室肌組織炎癥病灶中變性、壞死周圍心肌細胞Cx43表達明顯減弱甚至陰性，分布不規則，灰度值為（148±27），與對照組相比較差異有統計學意義（Ρ＜0.01）。磷酸肌酸鈉組Cx43陽性表達在兩心肌細胞連接閏盤處表達量較多，心肌細胞橫軸及胞質內可見弱陽性表達，灰度值為（134±18），與VMC組相比較差異有統計學意義（Ρ＜0.01）。見圖3、圖4。

圖3 ADM組織Cx43免疫組織化學染色結果

圖4 磷酸肌酸鈉組Cx43免疫組織化學染色結果

2.2.4 心室肌組織連接蛋白43蛋白表達：對照組小鼠心室肌組織Cx43表達量為（4.82±0.11）， ADM組小鼠的心室肌組織Cx43表達量為（1.65±0.09），與對照組比較差異有統計學意義（Ρ＜0.01）。磷酸肌酸鈉組小鼠的心室肌組織Cx43表達量為（3.12±0.17），與ADM組比較差異有統計學意義（Ρ＜0.01）。見圖5。

圖5 A為對照組，B為ADM組，C磷酸肌酸鈉組

3 討 論

縫隙連接（gap junction，GJ）是相鄰細胞間的跨膜通道，允許大分子物質如離子及第二信使通過，成為相鄰細胞間物質交換及信號傳導最直接方式。連接蛋白（connexins，CXs）是縫隙連接的組成成分，心臟中表達的連接蛋白在維持細胞間通訊，電信號傳導和正常節律性收縮中起重要作用。連接蛋白43（connexin43，Cx43）是心室縫隙連接的主要構成成分，其分布及功能的改變對于縫隙連接的活性有重要影響，連接蛋白合成減少是阿霉素所致心肌損傷大鼠并發心律失常的重要原因[4]。本實驗也證實，ADM損傷大鼠心肌CX43分布與正常組相比發生了一定的變化，其可能與ADM損傷大鼠并發心律失常的發生有一定的關系。ADM為蒽環類藥物，是一種抗癌藥物，對多種腫瘤均有效果，通過抑制mRNA生成而發揮抗腫瘤作用，ADM可以響細胞器的結構與功能，導致細胞器的形態結構的改變而損害組織，最終發生原發性細胞損傷，主要表現為對心臟毒性。ADM在機體的代謝過程中，產生大量的自由基產物，該產物改變了心肌細胞膜的通透性，導致心肌細胞細胞膜的脂質過氧化。ADM與心肌的親和力明顯高于與其他組織的親和力，心肌本身清除自由基的能力非常有限，這是ADM導致心功能降低和各種心律失常的主要原因[5]。磷酸肌酸鈉作為一種高效的能量供應物質，其分子結構中所含有的高能磷酸鍵是細胞的重要能源，，已經成為一種很好的心肌保護劑，其能夠為受損的細胞提供能源物質而對抗損傷。其機制為磷酸肌酸可進入細胞內線粒體、胞質膜、肌漿網及肌原纖維中，在CΡK及其同工酶的作用下將ADΡ轉化為ATΡ，促進了機體內紅細胞向組織提供更加充足的氧，為Na+-K+-ATΡ離子泵、Ca2+泵的能量供應提供了堅實的保證，明顯增加了細胞膜的穩定性[3]。本實驗研究結果顯示阿霉素所致心肌損傷大鼠急性期心肌組織Cx43蛋白表達下降并且ADM損傷大鼠心肌Cx43分布與正常組相比發生了一定的變化，磷酸肌酸鈉能明顯提高阿霉素所致心肌損傷大鼠急性期心肌組織Cx43蛋白表達并對ADM損傷大鼠所造成Cx43分布不規則，具有保護作用。 提示磷酸肌酸鈉可作為一種高效供能物質對ADM損傷大鼠并發心律失常的發生具有抑制作用，為磷酸肌酸鈉臨床有效治療阿霉素引起的心律失常提供理論依據。

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R965；R541.6

B

1671-8194（2014）10-0059-02

*通訊作者:E-mail: langzhe73@yahoo.com.cn