啤酒酵母對嘌呤類化合物吸收特征的研究

劉常姝，李 紅，崔云前，* ，王吉龍

（1.齊魯工業大學食品與生物工程學院，山東濟南 250353;2.中國食品發酵工業研究院，北京 100015;3.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安 271018）

飲用啤酒能夠引起血液中尿酸含量上升，從而引發高尿酸血癥及痛風，通過降低啤酒中的嘌呤含量有效避免這一現象［1－2］。目前有關低嘌呤啤酒的研究，常見方法有高比例輔料法、高濃發酵法和吸附法［3－7］。這些方法在低嘌呤啤酒的實際生產中仍面臨諸多問題，如高比例輔料法降低啤酒嘌呤物質含量的程度有限，而吸附法會引起啤酒風味損失［8］。因此，開辟新的嘌呤減少途徑對低嘌呤啤酒的生產有重要意義。

啤酒中的嘌呤主要來自麥芽，麥芽中的嘌呤溶于麥汁中［9－10］。研究表明，酵母能夠吸收培養液中嘌呤物質，用于維持自身的生長代謝與繁殖［11－12］。經酵母發酵后，發酵液殘留嘌呤，尤其是鳥嘌呤和腺嘌呤的含量明顯降低［13］，證明酵母吸收確實是可以降低啤酒嘌呤含量的有效途徑。因此，研究酵母對嘌呤物質的吸收規律，能夠更科學、更高效地利用酵母吸收嘌呤物質，從而降低啤酒嘌呤含量。

培養液中嘌呤有游離嘌呤和非游離嘌呤兩種存在形式，非游離嘌呤幾乎全部是以嘌呤核苷的形式存在［14－15］。水解核苷能夠顯著增加游離嘌呤的含量。嘌呤核苷酶能夠使核苷中非游離態嘌呤轉化成游離態［16］。麥芽自身含有的嘌呤核苷酶酶活非常低［17－19］，市面常見的嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）產品酶活相對較高，更適用于增加游離嘌呤含量。目前國內外對核酸水解酶的研究較多，但研究所得的目的產物均為核苷酸［20－21］，對水解核苷的嘌呤核苷酶的研究較少［22－24］，國內尚未有該方面研究。Shibano Y 等人從人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi）中提取了嘌呤核苷酶并用于生產低嘌呤啤酒，取得了一定成果［15］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

YPD液體培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司;鳥嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標準品HPLC 99%，美國Sigma公司;鳥苷、腺苷、肌苷、黃苷標準品 99%，北京索萊寶科技有限公司;嘌呤核苷磷酸化酶8.78U/mg，500U 北京世紀山水科技有限公司。

高效液相色譜儀 配有紫外檢測器和CLASS－VP工作站，日本島津;pH計PHS－3C 上海精密科學儀器有限公司;分析天平Tecator－6002 Switzerland公司;恒溫水浴鍋HX105 長流科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母吸收嘌呤實驗 向YPD液體培養基中分別添加不同含量的嘌呤及嘌呤核苷標準品，制得多組嘌呤含量不同的酵母培養液。其中，5組游離嘌呤與總嘌呤（游離與非游離嘌呤總和）含量均不相同的培養液用于研究酵母對不同形式嘌呤化合物吸收規律，記為培養液1、2、3、4、5;10 組游離嘌呤含量依次升高，總嘌呤含量相同的培養液用于研究麥汁嘌呤游離率對酵母的嘌呤吸收率的影響，記為W1～W10。取300mL培養液分裝至500mL三角瓶。無菌環境下接種適量酵母，發酵溫度控制在12±0.2℃，24h內每4h搖動一次，24h后加發酵栓，發酵7d，檢測發酵液的游離嘌呤及總嘌呤含量。每組實驗做三個平行。

1.2.2 PNP反應體系與反應條件實驗 酶液配制:分別稱取 0.0200、0.0400、0.0800g PNP 酶，用 pH7.0磷酸鉀緩沖液定容至10mL，配制成2、4、8mg/mL的酶液A、酶液B、酶液C，4℃保存待用。PNP反應實驗:取4 支試管，各加 5mL 麥汁，編號 0、1、2、3，分別加入100μL磷酸鉀緩沖液、酶液A、酶液B、酶液C，30℃反應10min。煮沸2min終止反應，冷卻后，檢測反應液的游離嘌呤及總嘌呤;另取3支試管，反應體系與反應溫度同上，反應時間分別為10、30、60min。上述實驗均做三次平行。

1.2.3 樣品處理方法 參考文獻［25］，游離嘌呤檢測樣品:取1mL樣品，經0.45μm膜過濾，直接進樣檢測;總嘌呤檢測樣品:樣品超聲5min除氣，取2mL于10mL比色管，加入 2mL 3mol/L硫酸溶液，100℃水解5min，冰浴冷卻，加入4mL 3mol/L NaOH中和，用超純水定容至10mL，經0.45μm膜過濾后進樣。

1.2.4 液相色譜條件 參考文獻［26－27］，色譜柱:Thermo Hypersil GOLD AQ（4.6mm × 250，5μm）;柱溫:25℃;流 動 相:0.02mol/LKH2PO4緩 沖 液（pH4.00）;流速1mL/min;進樣量:10μL;紫外檢測波長:254nm。

1.2.5 數據處理 為了研究方便，本文中提出了兩個概念。一是嘌呤游離率，其定義為培養液游離嘌呤含量與總嘌呤含量的百分比，表示嘌呤的游離程度;二是酵母的嘌呤吸收率，其定義為被酵母吸收的嘌呤量與培養液游離嘌呤含量的比值，用來表示酵母對嘌呤的吸收能力。二者的計算公式分別為:

2 結果與分析

2.1 酵母對嘌呤類化合物吸收規律的研究

2.1.1 酵母對不同形式嘌呤化合物吸收規律的研究5組嘌呤含量各不相同的培養液發酵前（BF）與發酵后（AF）游離鳥嘌呤（FG）、游離次黃嘌呤（FH）、游離黃嘌呤（FX）、游離腺嘌呤（FA）以及總游離嘌呤（TFG）含量見表1，麥汁發酵前后非游離鳥嘌呤（NFG）、非游離次黃嘌呤（NFH）、非游離黃嘌呤（NFX）、非游離腺嘌呤（NFA）以及總非游離嘌呤（TNFP）含量見表2。

由表1可以看出，5種嘌呤含量的培養液經過發酵后，各種游離嘌呤含量明顯低于發酵前。對表中數據分析可知，發酵前后非游離的鳥嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤以及總嘌呤含量均呈顯著正相關關系，相關系數分別為 0.985、0.985、0.989、0.935、0.985（p＜0.05）;發酵前后游離態的鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤以及總嘌呤的均值差值分別為13.58、1.88、1.44、16.86和33.86mg/L（p＜0.05），說明發酵前游離嘌呤的含量高于發酵后，差異顯著。由此可以證明，酵母能夠吸收利用游離嘌呤。

另外，由表1還可看出發酵后仍有少量游離嘌呤存在，可見酵母無法完全利用培養液中的游離嘌呤。

由表2可以看出，5種嘌呤含量的培養液經過發酵后，各種非游離嘌呤含量與發酵前相比基本無變化。

經過數據分析可知，發酵前后非游離的鳥嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤以及總嘌呤含量均呈顯著正相關關系，相關系數分別為0.999（p＜0.01）、0.993（p＜0.01）、0.983（p＜0.01）、0.998（p＜0.01）、0.999（p＜0.01）;上述非游離嘌呤對應的均值差值分別為0.66、－0.12、－0.10、0.04 和 0.52mg/L（p＞0.05），說明發酵前后非游離嘌呤的含量均無顯著差異。由此可以證明，發酵過程中非游離嘌呤含量不發生變化，即酵母不能吸收利用非游離嘌呤。個別檢測值為負是由液相檢測方法的準確性導致的誤差。

綜上可知，酵母能且只能吸收游離形態的嘌呤，但不能將游離嘌呤完全吸收。因此，研究酵母對培養液嘌呤的吸收規律，即研究酵母對培養液中游離嘌呤的吸收規律。

2.1.2 培養液嘌呤游離率對酵母的嘌呤吸收率的影響 W1～W10十種不同培養液的鳥嘌呤（G）、次黃嘌呤（H）、黃嘌呤（X）、腺嘌呤（A）和總嘌呤（TP）的游離率見圖1，酵母對各嘌呤的吸收量以及吸收率分別見圖2和圖3。

表1 培養液發酵前后游離態嘌呤含量Table 1 The content of free purines of 5 worts before and after fermentation

表2 培養液發酵前后非游離態嘌呤含量Table 2 The content of non－free purines of 5 worts before and after fermentation

圖1 10組不同培養液的嘌呤游離率Fig.1 The purine dissociation rate of 10 different worts

圖2 酵母對10組不同培養液的嘌呤吸收量Fig.2 The purine absorption of 10 different worts

由圖1和圖2可以看出，隨著培養液中嘌呤游離程度的增加，酵母對各種嘌呤的吸收量升高。酵母的嘌呤吸收量與培養液的嘌呤游離率之間相關性顯著（鳥嘌呤R2＞0.990，p＜0.01;次黃嘌呤R2＞0.991，p＜0.01;黃嘌呤R2＞0.998，p＜0.01;腺嘌呤R2＞0.996，p＜0.01;總嘌呤R2＞0.995，p＜0.01）。由于酵母從胞外吸收游離嘌呤的主要途徑是主動運輸，當培養液中總嘌呤含量一定時，嘌呤游離率越高，游離嘌呤含量越高，與酵母細胞膜上載體結合概率越大，酵母越容易從外部獲得嘌呤，因此導致酵母對各種嘌呤的吸收量升高。

圖3 酵母對10組不同培養液的嘌呤吸收率Fig.3 The purine absorption rate of 10 different worts

另外，酵母吸收 G、H、X、A、TP增加量與培養液中對應嘌呤增加量的均值差值分別為－1.12（p＞0.05）、－0.04（p＞0.05）、－0.15（p＞0.05）、－0.16（p＞0.05）、－1.14（p＞0.05），即酵母吸收嘌呤的增加量均低于相應嘌呤在培養液中的增加量。說明培養液中增加的游離嘌呤無法被酵母完全吸收。

由圖1和圖3可以看出，隨著培養液中嘌呤游離程度的增加，酵母對各種嘌呤的吸收率變化并不一致?？偟膩碚f，當嘌呤游離率小于90%時，隨著培養液中嘌呤程度的增加，酵母對游離嘌呤的整體吸收率基本不變;當嘌呤游離率大于90%時，酵母對嘌呤的吸收率略有降低。

其中，對于培養液中的次黃嘌呤、黃嘌呤，隨著培養液中嘌呤游離程度的增加，其吸收率均呈升高趨勢。說明酵母吸收嘌呤的增加速度大于培養液游離嘌呤的增加速度。在游離次黃嘌呤、游離黃嘌呤含量較低的條件下，其含量變化對酵母吸收這兩種嘌呤的影響極大，酵母吸收嘌呤的能力呈非線性增長，從而引起吸收率增高的現象。

對于G、A，當嘌呤游離率小于90%時，隨著培養液中嘌呤程度的增加，酵母對這兩種嘌呤的吸收率基本不變;當嘌呤游離率大于90%時，吸收率明顯降低。這是因為培養液中這兩種嘌呤整體含量水平較高，而酵母對游離嘌呤的吸收能力有一定限度，當培養液中G、A含量過高時（G＞19.8±0.5mg/L，A＞20.1±0.4mg/L），酵母不能充分利用多出來的游離嘌呤，因此，酵母對這兩種游離嘌呤的吸收率反而降低，這與酵母在該條件下嘌呤吸收量升高并不矛盾。

綜上可知，當嘌呤含量極低時，酵母對嘌呤的吸收率隨嘌呤游離率的增加而增加;當嘌呤含量適中時，酵母對嘌呤的吸收率維持在一定水平，不隨嘌呤游離率的增加而改變;當嘌呤含量過高時，隨著嘌呤游離率的增加，酵母的嘌呤吸收率逐漸下降。

另外，由圖3還可看出，其中腺嘌呤的吸收率始終是四種嘌呤中最高的，基本維持在100%。其次是次黃嘌呤、鳥嘌呤和黃嘌呤。

上述結論表明，增加培養液中游離嘌呤比例，能夠有效增加酵母對游離嘌呤的吸收量，從而減少啤酒中的嘌呤含量。

2.2 PNP對麥汁嘌呤的影響

為了研究PNP對麥汁嘌呤含量的影響，本文以麥汁為底物，添加適量PNP酶制劑進行反應。

2.2.1 PNP添加量對麥汁中游離嘌呤的影響 向一定量麥汁中添加不同含量的PNP酶，檢測添加后麥汁嘌呤變化。不同PNP酶添加量麥汁中嘌呤游離率見圖4。

圖4 PNP添加量對4種嘌呤游離率的影響Fig.4 The effect of PNP addition on 4 kinds purine dissociation rate

由圖4可以看出，隨著PNP添加量的增加，麥汁中整體游離嘌呤含量呈明顯的增加趨勢。其中，當酶添加量由0U增加至0.7U時，總游離嘌呤含量增加了28.5±0.6%。其中，麥汁中FG、FH、FX含量分別增加了59.8±0.1%、117.9±2.6%和增加了33.7±0.2%，但FA含量降低了12.0±0.2%。說明PNP在本實驗條件下，水解腺苷糖苷鍵的反應為逆向反應，即反應向著游離嘌呤和核糖生成腺苷的方向進行。

麥汁中的嘌呤未能完全游離出來。這是由于PNP催化反應是可逆反應，本實驗條件下已達到平衡狀態。另外，由于PNP是以核苷為底物，不能分解麥汁中核苷酸等含嘌呤的化合物，因此結束后仍存有少量的聚合態嘌呤。

上述結論表明，PNP酶能夠水解麥汁中核苷的糖苷鍵，使麥汁中游離嘌呤含量明顯增高。只是由于PNP反應底物以及反應自身特點的限制，若要提高PNP對麥汁核苷的水解效果，還需進一步的研究。

2.2.2 嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）催化反應的反應時間對麥汁中游離嘌呤含量的影響 不同反應時間，麥汁中游離嘌呤含量及總嘌呤含量見圖5。

圖5 PNP反應時間對4種嘌呤游離率的影響Fig.5 The effect of PNP reaction time on 4 kinds of purine dissociation rate

由圖5可以看出，反應10min后麥汁中游離嘌呤含量基本不變。說明PNP催化反應十分迅速，反應10min基本達到平衡。相對于麥汁制備過程所需時間（2～4h），PNP反應快速，具有對工藝時間影響較小的優勢。

3 結論

研究結果表明，酵母只能夠吸收麥汁中游離形式的嘌呤，且隨著麥汁中嘌呤游離率的增加，酵母吸收的嘌呤含量也隨之增高。因此，通過酵母吸收的形式降低啤酒嘌呤，關鍵在于增加麥汁的嘌呤游離率。同時證實，PNP對麥汁中的核苷確實有明顯的水解效果，能夠增加麥汁的嘌呤游離率;且PNP催化反應時間較快，對麥汁的生產工藝影響較小。上述結論對于低嘌呤啤酒的生產具有一定指導意義及參考價值。同時，PNP酶在本實驗條件下對核苷的水解能力有限，還需進一步提高PNP的水解能力。

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