番茄紅素對小鼠肝纖維化的保護作用

趙凱

（江蘇大學附屬金壇醫院消化科，江蘇金壇213200）

番茄紅素對小鼠肝纖維化的保護作用

趙凱

（江蘇大學附屬金壇醫院消化科，江蘇金壇213200）

目的：探討番茄紅素對刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）誘導的小鼠肝纖維化的干預作用。方法：24只小鼠隨機均分為3組，對照組、模型組及預防組。模型組小鼠予以腹腔注射Con A（20 mg／kg），每周1次，對照組腹腔注射等量PBS溶液，預防組在注射Con A的同時予番茄紅素灌胃（20 mg／kg），每天1次，8周后處死小鼠。收集血液檢測肝纖維化指標，測定肝組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛水平，病理學及半定量計分系統（semi-quantitative scoring system，SSS）觀察肝纖維化程度，免疫印跡法檢測α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Smad3蛋白、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達。結果：與對照組比較，模型組血清透明質酸（hyaluronic acid，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前膠原（procollagen typeⅢ，PCⅢ）水平，SSS計分，丙二醛，α-SMA、TGF-β1、Smad3的表達明顯增加，SOD表達明顯降低；與模型組相比，預防組HA、LN、PCⅢ水平，SSS計分，丙二醛，α-SMA、TGF-β1、Smad3的表達明顯降低，SOD表達明顯升高（P＜0.01）。結論：番茄紅素通過減輕過氧化損傷，保護肝細胞，減少膠原生成，抑制α-SMA、TGF-β1及Smad3等致纖維化因子的表達，從而抵抗Con A誘導的肝纖維化作用。

番茄紅素；肝纖維化；小鼠

脂質過氧化損傷能破壞肝細胞，促使肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）增殖及活化，α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肝星狀細胞活化的標志，轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是重要的致肝纖維化細胞因子之一，TGF-β1／Smad3信號通路在肝纖維化形成過程中起著重要作用。番茄紅素是一種脂溶性不飽和碳氫化合物，類胡蘿卜素的一種，具有抗氧化、抗腫瘤、調節免疫等作用。研究發現，番茄紅素具有對抗實驗小鼠肝纖維化作用［1］。我們采用刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）腹腔注射昆明小鼠建立肝纖維化實驗模型［2］，通過番茄紅素干預治療，檢測小鼠肝纖維化指標、病理學改變、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛水平的變化及α-SMA、Smad3、TGF-β1的表達，探討番茄紅素抗小鼠肝纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 昆明小鼠由江蘇大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCXK（蘇）2009-0002，動物使用許可證號：SYXK（蘇）2008-0024。

1.1.2 主要藥物及試劑 番茄紅素（純度99%）購自上海英軒醫藥有限公司，批號20110411；Con A購自Sigma公司，批號L-7647；SOD、丙二醛試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，批號20110726；α-SMA購自武漢博士德公司，批號BM002；Smad3兔多克隆抗體、TGF-β1兔多克隆抗體購自英國Abcam公司，批號分別為SC-8332、SC-146。

1.2 實驗方法

24只小鼠隨機分3組，每組8只。模型組小鼠予以腹腔注射Con A，20 mg／kg，每周1次，對照組腹腔注射等量PBS溶液，預防組在注射Con A的同時予番茄紅素灌胃，20 mg／kg，每天1次。共8周。小鼠均摘除眼球取血，然后頸椎脫臼處死，取肝組織。

1.3 觀察指標及檢測

1.3.1 血清肝纖維化指標檢測 采用放射免疫法檢測透明質酸（hyaluronic acid，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前膠原（procollagen typeⅢ，PCⅢ）含量。

1.3.2 肝組織病理學檢查 采用HE及Masson染色進行病理學檢查，半定量計分系統（semi-quantitative scoring system，SSS）觀察肝纖維化程度。

1.3.3 SOD和丙二醛測定 稱取0.2 g肝組織配成10%組織勻漿液，10 000 r／min離心10 min，取上清測定SOD和丙二醛含量。

1.3.4 免疫印跡法檢測α-SMA、TGF-β1、Smad3表達 取肝左葉同一部位組織，組織裂解液充分裂解，液態研磨，4℃，12 000 r／min離心10 min。SDSPAGE電泳，電轉移至PVDF膜，封閉2 h，加入α-SMA、TGF-β1、Smad3和β-肌動蛋白一抗，4℃孵育過夜。次日TBST充分洗膜3次，每次5 min，加入HRP標記的二抗，室溫搖床孵育2 h，洗去未結合的二抗，于暗室用ECL法檢測反應產物，采用Quantity One圖像分析系統分析各條帶平均灰度值，以目的條帶灰度值與內參照β-肌動蛋白灰度值的比值表示α-SMA、TGF-β1及Smad3的相對表達量。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 番茄紅素對肝纖維化血清學指標的影響

見表1，與對照組比較，模型組HA、LN、PCⅢ表達均明顯升高（P均＜0.01）；與模型組比較，預防組HA、LN、PCⅢ表達明顯降低（P均＜0.01）。

表1 各組肝纖維化血清學指標的比較n＝8，±s

表1 各組肝纖維化血清學指標的比較n＝8，±s

a：P＜0.01，與對照組比較；b：P＜0.01，與模型組比較

組別 HA（μg·L－1）LN（μg·L－1）PCⅢ（μg·L－1）對照組64.00±12.17 73.13±10.53 66.38±7.96模型組432.50±28.53a 133.13±10.38a 231.88±15.83a預防組121.88±23.03b 87.00±7.82b 90.00±6.32b F值631.54 84.58 543.08 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 小鼠肝臟組織病理變化

如圖1所示，對照組肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊，無纖維增生；模型組多數肝小葉破壞、結構紊亂，匯管區擴大，中央靜脈外周有纖維條索向外周延伸，部分區域出現纖維間隔；預防組肝小葉結構完整，可見炎細胞浸潤，小葉內見點灶狀壞死，少量纖維組織增生。

對照組、模型組和預防組SSS計分分別為（0.75±0.46）分、（7.38±1.19）分和（2.38±0.92）分，3組間差異有統計學意義（F＝116.11，P＜ 0.01）；模型組SSS計分明顯高于對照組和預防組 （P＜0.01）。

圖1 各組小鼠肝組織病理結構（×200）

2.3 番茄紅素對肝組織中SOD和丙二醛的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組SOD表達明顯降低、丙二醛表達明顯升高（P均＜0.01）；與模型組比較，預防組SOD表達明顯升高、丙二醛表達明顯降低（P均＜0.01）。

表2 各組小鼠肝組織SOD和丙二醛的比較n＝8，±s

表2 各組小鼠肝組織SOD和丙二醛的比較n＝8，±s

a：P＜0.01，與對照組比較；b：P＜0.01，與模型組比較

組別 SOD（U·mg－1） 丙二醛（nmol·mg－1）對照組113.88±8.53 1.16±0.23模型組 63.38±10.58a 3.39±0.31a預防組 103.38±13.00b 1.49±0.12b F值48.20 208.63 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.4 各組小鼠肝組織α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白的表達

α-SMA、TGF-β1及Smad3在模型組中呈高表達，而在對照組及預防組中呈低表達（α-SMA：F＝272.53；TGF-β1：F＝147.08；Smad3：F＝118.58，P均＜0.01）。與對照組比較，模型組α-SMA、TGF-β1及Smad3的表達明顯升高；與模型組比較，預防組α-SMA、TGF-β1及Smad3的表達明顯降低（P均＜0.01）。見圖2、圖3。

3 討論

圖2 免疫印跡法檢測α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白表達

圖3 各組小鼠肝組織α-SMA、TGF-β1及Smad3相對表達量

肝纖維化發生的關鍵是HSC的激活和細胞外基質（ECM）的過度沉積。脂質過氧化是肝臟炎癥損傷發展至肝纖維化的橋梁，自由基以及脂質過氧化物直接刺激或通過旁分泌刺激HSC使其活化，誘導肝纖維化的發生［3］。丙二醛是脂質過氧化的產物，反映自由基對肝細胞的損傷程度，SOD能清除超氧陰離子等自由基保護細胞免受損傷［4］。當肝臟受到物理、化學及生物因素刺激時，HSC增殖并激活，轉變為肌成纖維細胞，通過旁分泌和自分泌合成大量的ECM，并表達α-SMA［5］。α-SMA是HSC活化及肌成纖維細胞激活的特征性標志物［6］。近年來針對TGF-β1／Smad3研究藥物抗肝纖維化作用已成為纖維化防治的熱點［7－8］。作為最重要的致肝纖維化細胞因子之一，TGF-β1能夠抑制肝細胞的增殖，激發HSC的活化，促進ECM的產生［9］。TGF-β1信號傳導通路中的關鍵因子Smad3是HSC活化的重要媒介，減少Smad3的激活是下調Ⅰ型膠原表達的關鍵步驟［10］，而Smad3缺失能夠對抗肝臟纖維化［11］。

本實驗通過ConA腹腔注射昆明小鼠建立肝纖維化模型，結果顯示模型組HA、LN及PCⅢ明顯增高，肝組織病理學及SSS計分符合肝纖維化表現，說明造模成功。預防組血清肝纖維化指標下降，病理學改善明顯，進一步證實番茄紅素具有抗肝纖維化作用。此外，通過番茄紅素干預可明顯增加SOD含量，降低丙二醛含量；小鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、Smad3的水平明顯降低，提示番茄紅素能減輕過氧化損傷，保護肝細胞，減少膠原生成，并能抑制重要的致纖維化因子α-SMA、TGF-β1及Smad3的表達，具有良好的抗纖維化作用。

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Protective effect of lycopene on hepatic fibrosis in m ice

ZHAO Kai
（Department of Gastroenterology，Jintan Hospital Affiliated to Jiangsu University，Jintan Jiangsu 213200，China）

Objective：To investigate protective effect of lycopene on liver fibrosis in mice induced by concanavalin A（Con A）.M ethods：Twenty-four mice were equally randomized into 3 groups：control group，model group and prevention group.Themice inmodel group was received intraperitoneal injection of CoA（20 mg／kg），one time per week，while control group received normal saline，prevention group was received intragastric administration of lycopene，one time per day，for 8 weeks.Mice blood were collected to test the indices of hepatic fibrosis.Grade of hepatic fibrosiswere evaluated according to the semi-quantitative scoring system（SSS）.Western blotting was used to test the expression ofα-smooth muscle actin（α-SMA），Smad3 protein（Smad3）and transforming growth factor-β1（TGF-β1）.Results：Compared with the control group，themodel group showed higher serum levels of hyaluronic acid（HA），laminin（LN），procollagen typeⅢ（PCⅢ），SSSscore，malonaldehyde level，the expression ofα-SMA，TGF-β1and Smad3，lower superoxide dismutase（SOD）（both P＜0.01）；compared with the model group，the prevention group showed lower serum levels of HA，LN，PCⅢ，SSS score，malonaldehyde level，the expression ofα-SMA，TGF-β1and Smad3，higher levels of SOD（both P＜0.01）.Conclusion：Lycopene could sharply decrease the harm of peroxidation，protect the liver cells，reduce the collagen production and restrain the expression of the important factor ofα-SMA，Smad3，TGF-β1which lead to liver fibrosis，so that lycopene had the notable alleviate effect on liver fibrosis induced by ConA.

lycopene；hepatic fibrosis；mice

趙凱（1974—），男，江蘇金壇人，副主任醫師，主要從事肝臟疾病的基礎和臨床研究。

R575.2

A

1671－7783（2014）04－0290－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140157

金壇市科技局計劃項目（TS2010073）

2014－05－01 ［編輯］劉星星