非編碼小RNA T64對傷寒沙門菌基因表達的影響

王哲鑫，吉瀅，趙昕，徐順高，黃新祥

（江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013）

非編碼小RNA T64對傷寒沙門菌基因表達的影響

王哲鑫，吉瀅，趙昕，徐順高，黃新祥

（江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013）

目的：對由轉錄組測序獲得的傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi）非編碼小RNA（small non-coding RNA，snRNA）T64的表達進行驗證，并對其功能進行初步探討。方法：選取特異性引物采用反轉錄PCR（RT-PCR）和普通PCR確認T64在S.Typhi中的表達；將含有T64 snRNA序列的重組質粒導入S.Typhi野生株構建T64高表達株；結合應用S.Typhi全基因組芯片分析技術，比較S.Typhi T64高表達株和空載體對照株在對數期基因表達譜差異，并對部分基因芯片結果進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證。結果：RT-PCR結果顯示，snRNA T64在S.Typhi確有表達；基因芯片分析結果顯示，與空載體對照株比，snRNA T64高表達株在對數期有20個基因表達上調，7個下調；4個被選基因表達的qRT-PCR結果與芯片分析結果相符。結論：snRNA T64在S.Typhi中表達，可能在基因的表達調節中發揮重要作用。

傷寒沙門菌；非編碼小RNA；基因芯片分析；實時熒光定量PCR；基因表達調節

近年來，人們對生物體內非編碼小RNA（small non-coding RNA，snRNA）的研究日益增多。snRNA作為新的基因表達調控因子的作用也引起了重視［1］。轉錄組測序是發現細菌中snRNA的強有力手段，結合生物信息學學者們發現和證實了150余種snRNA，主要存在于大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）、銅綠假單胞菌、霍亂弧菌等細菌中［2］。這些snRNA大多通過不完全配對方式與一個或多個靶基因的mRNA堿基形成互補配對［3－5］，于轉錄后水平影響基因的表達［6］，在細菌生長、代謝、應激等生命過程中發揮重要作用［7－8］。

借助前期對轉錄組測序數據和生物信息學分析，我們預測傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi）中存在一個新的snRNA，命名為T64。本文將對T64 snRNA的表達進行驗證，并應用S.Typhi全基因組DNA芯片［5］和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術，分析其對S.Typhi基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 S.Typhi野生株GIFU10007由日本岐阜大學醫學院微生物系饋贈；E.coli TOP-10、E.coli DH5α由本實驗室保存；snRNA高表達所用質粒pBAD／Myc-His A為Promega公司產品。

1.1.2 主要材料與試劑 NcoⅠ和Hin dⅢ限制性內切酶、T4DNA連接酶、DNA酶Ⅰ、r Taq酶、Ex Taq DNA聚合酶、TA克隆試劑盒均購自大連TaKaRa公司；質粒提取試劑盒購自Axygen公司；總RNA提取試劑盒、cDNA純化試劑盒購自Qiagen公司；反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司；熒光標記染料Cy3／Cy5-dCTP購自Amersham公司；qRT-PCR 96孔板購自Bio-Rad公司；S.Typhi基因組芯片為本實驗室自制［9］。

1.1.3 主要儀器 PCR擴增儀（ABI公司）；凝膠成像分析系統（Syngene公司）；ND-100核酸檢測儀（NanoDrop公司）；CFX96TM實時熒光定量系統（Bio-Rad公司）；Gene PulseroⅡ電轉化儀（Bio-Rad公司）；Genepix personal 4100A基因芯片掃描儀（Axon公司）。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設計 使用Oligo 6.0軟件設計引物，根據轉錄組分析和生物信息學分析得到snRNA T64的上下游序列，分別設計帶有NcoⅠ和Hin dⅢ酶切位點的特異性引物64FP／64RP。根據S.Typhi基因組序列，分別設計lctD、invF、sopE和rbsB基因的特異性引物，用于qRT-PCR。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，序列詳見表1。

表1 引物的序列及用途

1.2.2 RT-PCR驗證T64表達 選取LB平板培養的S.Typhi野生株，溶于雙蒸水后煮沸10 min，12 000 r／min離心10 min，取上清作為細菌基因組的DNA模板，作為PCR對照。提取野生株總RNA，利用snRNA T64特異性引物PB反轉錄合成cDNA。接著以特異性引物T64 PA／T64 PB作為PCR引物，分別以水，總RNA，基因組DNA，cDNA為模板進行PCR擴增，將得到的產物進行凝膠電泳。

1.2.3 S.Typhi T64高表達株構建 以S.Typhi野生株基因組DNA為模板，用64FA／64FB引物進行PCR擴增，得到帶有NcoⅠ和Hin dⅢ雙酶切位點的產物片段。用NcoⅠ和Hin dⅢ對擴增產物片段和質粒pBAD／Myc-His A進行雙酶切，然后用T4連接酶將片段和質粒連接，并導入E.coli DH5α。用Axygen試劑盒提取質粒，作酶切和PCR初步驗證，最后經上海生工生物工程有限公司基因測序確證T64高表達株制備成功。同樣用pBAD空質粒導入野生株作為對照。

1.2.4 總RNA提取 取T64高表達株和空載體對照株的單菌落各1個，分別接種于2 mL LB培養液中，37℃，250 r／min培養18 h；再取300μL過夜菌液轉接入30 mL LB培養液（1∶100），以相同條件培養至對數生長期［D（600 nm）＝0.4］；每管中加入L-阿拉伯糖（終質量濃度為0.5 mg／mL），繼續培養30 min，誘導T64表達；4℃，10 000 r／mm，離心2 min收集菌體；提取兩株細菌總RNA，加DNA酶Ⅰ于37℃孵育30 min，以去除殘留基因組DNA；再于80℃孵育3 min以滅活DNA酶Ⅰ；最后用核酸檢測儀測RNA的濃度以及D（260 nm）／D（230 nm）比值。取3～5μg樣品，進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA質量和基因組DNA殘留情況［9］。

1.2.5 RNA反轉錄及基因組芯片分析 RNA反轉錄及基因組芯片分析方法參考文獻［9］進行，各取高表達株和空載體對照株RNA 30μg進行反轉錄，并用Cy3／Cy5配對互標cDNA；純化標記好的cDNA，于42℃與S.Typhi基因組芯片雜交12 h；基因芯片掃描儀掃描后，通過軟件GenePix Pro 6.0將熒光信號數據化和標準化，最后用Excel進行比對分析。

高表達株的基因表達熒光信號值／對照株的基因表達熒光信號值，取log2表示這兩株中基因表達差異的程度。log2為正值，表示基因表達在高表達株中上調；反之，負值則為下調。以數據log2絕對值≥1為篩選閾值。

1.2.6 qRT-PCR分析 細菌RNA提取方法同上，取總RNA 4μg，各基因的特異性下游引物進行反轉錄，再用基因上下游特異性引物進行qRT-PCR［9］。實驗重復3次，每次各做3個平行。

1.3 統計分析

數據分析采用SPSS 11.0統計軟件。兩組間均數比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 S.Typhi snRNA T64表達驗證

見圖1，第4泳道擴增產物長度為155 bp，與設計的T64特異性片段長度一致，且與第3泳道結果一致；第1、2泳道無特異片段產物。結果提示，S.Typhi確實有snRNA T64的表達。

2.2 S.Typhi snRNA T64高表達株的制備

PCR擴增得到帶有NcoⅠ和Hin dⅢ雙酶切位點的產物片段P1，長度為150 bp。酶切和PCR初步驗證顯示，在疑似陽性質粒中有目的酶切片段。最后經測序分析證實，重組質粒制備成功。將重組質粒導入S.Typhi野生株，獲得snRNA T64高表達株。見圖2。

圖1 RT-PCR驗證S.Typhi snRNA T64表達

圖2 S.Typhi snRNA T64高表達株的制備結果

2.3 S.Typhi snRNA T64高表達株和pBAD／Myc-His A對照株基因表達譜差異

結果顯示，與空載體對照株相比，snRNA T64高表達株有20個基因表達上調，7個基因表達下調。具體基因功能及表達變化見表2。

2.4 qRT-PCR驗證基因表達差異

挑選芯片分析有表達差異的4個基因進行qRT-PCR驗證。結果顯示，高表達T64后，invF、sopE和rbsB基因表達均明顯上調，lctD基因表達明顯下調，提示qRT-PCR分析結果與芯片分析獲得的結果基本一致。見圖3。

3 討論

隨著RNA測序技術的發展和應用，越來越多的細菌snRNA被發現，其相應的功能研究也已成為熱點。在我們的前期工作中，通過轉錄組和生物信息學分析，在S.Typhi發現了一個新的snRNA，命名為T64。本研究采用RT-PCR的方法第1次初步證實了其在S.Typhi中存在表達。我們通過構建高表達株和空載體對照株，利用本實驗室建立的基因芯片平臺，觀察snRNA T64高表達后對細菌整體基因表達的影響。結果顯示，27個基因表達有明顯變化，其中，20個基因表達上調，7個下調。采取qRTPCR對其中4個基因進行驗證，驗證結果與基因芯片結果基本相一致。

基因芯片分析結果顯示，表達差異的基因集中在與細菌毒力和代謝相關的基因，例如invF，一個重要的沙門菌致病島Ⅰ的毒力調節基因［10－12］，對sip家族基因的表達具有促進作用［13］。此外，還觀察到sipC基因表達上調，提示snRNA T64可能通過調控invF來參與細菌其他毒力基因的調節。另外，一些核糖體蛋白基因及酶基因的表達下調提示該snRNA T64在對數期參與S.Typhi的生長和代謝相關基因的調控。S.Typhi snRNAT64對invF和另外基因具體的作用機制目前尚不清楚，還需要深入研究。

總之，本研究進一步驗證了S.Typhi存在snRNA T64表達；對其可能發生作用的靶基因進行初步篩選，發現snRNA T64可能參與調節invF和其他基因的表達，在S.Typhi致病基因的表達調節中發揮重要作用。

表2 基因芯片分析snRNA T64高表達株與對照株基因表達差異結果

圖3 qRT-PCR驗證基因芯片分株結果

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Influence of snRNA T64 on gene expression in Salmonella enterica serovar Typhi

WANG Zhe-xin，JIYing，ZHAO Xin，XU Shun-gao，HUANG Xin-xiang
（School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To identify the expression of samll non-coding RNA（snRNA）T64 detected by transcriptome sequencing in Salmonella enterica serovar Typhi（S.Typhi）and explore its functions preliminarily.M ethods：The native expression of snRNA T64 in S.Typhi was confirmed by reverse transcription PCR（RT-PCR）and PCR with specific primers.Overexpression strain of snRNA was constructed by transforming a recombinant plasmid containing sequence of snRNA T64 to the wild type strain of S.Typhi.Microarray was used to analyse the gene expression difference between overexpression strain and control strain in logarithmic growth phase.Some microarray results were confirmed by quantitative real-time PCR（qRTPCR）.Results：The expression of snRNA T64 was confirmed by the RT-PCR.The results ofmicroarray assay revealed that there were 20 genes expression upregulated in the overexpression strain of snRNA T64，while 7 genes expression downregulated，compared with the control strain in logarithmic growth phase.qRTPCR results of expressions of4 selected genesmatched themicroarray results.Conclusion：There were expression of snRNA T64 in S.Typhi，which might play important roles in gene expression regulation.

Salmonella enterica serovar Typhi；small non-coding RNA；microarray assay；quantitative real-time PCR；gene expression regulation

R516.3

A

1671－7783（2014）04－0298－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140092

王哲鑫（1986—），男，碩士研究生；黃新祥（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：huxinx＠yahoo.com.hk

2014－04－08 ［編輯］劉星星