外源性一氧化碳釋放分子對大鼠隨意窄蒂皮瓣缺血 再灌注損傷的保護作用

高亮，邰寧正

（江蘇大學附屬醫院燒傷整形科，江蘇鎮江212001）

外源性一氧化碳釋放分子對大鼠隨意窄蒂皮瓣缺血 再灌注損傷的保護作用

高亮，邰寧正

（江蘇大學附屬醫院燒傷整形科，江蘇鎮江212001）

目的：觀察外源性一氧化碳釋放分子（CO-releasingmolecule-2，CORM-2）在皮瓣缺血再灌注損傷（ischemiareperfusion injury，IRI）過程中發揮的作用。方法：將大鼠隨機分為CORM-2組和對照組，每組各18只，設計隨意窄蒂皮瓣IRI模型，術后即刻尾靜脈注射CORM-2（8 mg／kg）；對照組：尾靜脈注射等量的生理鹽水。兩組每隔24 h給藥1次，直到術后第7天。術后24 h檢測兩組大鼠皮瓣組織勻漿液NF-κB活性；術后第3、5、7天分別檢測上述兩組皮瓣組織中丙二醛含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；大鼠心臟取血，檢測血清IL-6和TNF-α水平；術后第3、5、7天對兩組皮瓣蒂部進行組織學檢查；拍照記錄并計算術后第7天兩組皮瓣的成活率。結果：①皮瓣術后第3、5、7天，與對照組比較，CORM-2組皮瓣組織中丙二醛含量明顯下降（P＜0.01），SOD活性明顯升高（P＜0.01）。②皮瓣術后第3、5、7天，CORM-2組血清中IL-6和TNF-α水平明顯降低（P＜0.01）。③術后24 h CORM-2組NF-κB活性明顯降低，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。④組織學檢查發現CORM-2能明顯促進皮瓣蒂部組織毛細血管增生。⑤皮瓣術后第7天，CORM-2組皮瓣成活率明顯高于對照組（P＜0.01）。結論：CORM-2可有效降低大鼠窄蒂皮瓣的IRI，明顯提高了皮瓣成活率。

CORM-2；窄蒂皮瓣；缺血再灌注損傷；丙二醛；超氧化物歧化酶；白介素-6；腫瘤壞死因子-α；NF-κB

狹長窄蒂皮瓣屬于一種特殊的隨意型皮瓣［1］，本質上是由一個類似狹長皮瓣的蒂部（同樣不包含知名血管）攜帶一個具有一定長寬比的皮瓣所構成的隨意型皮瓣。研究證明一定長寬比的狹長窄蒂所能攜帶的任意皮瓣成活面積有其最大值，超過該值后皮瓣遠端會發生壞死［2－3］。導致壞死的根本原因是超范圍的皮瓣在術后存在缺血 再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）及因IRI引發的一系列炎癥和氧化應激反應。近年來國內外的多種實驗研究顯示外源性一氧化碳釋放分子（CO-releasing molecule-2，CORM-2）在IRI［4］、膿毒癥引起的氧化應激反應［5］等病理生理過程中發揮重要的生理作用，且具有明顯的抗炎作用［6］。但有關CORM-2在皮瓣中的應用研究還未見報道。本研究構建大鼠合適比例隨意型窄蒂皮瓣IRI模型，利用CORM-2進行干預，觀察CORM-2對皮瓣存活的影響，探討CORM-2在窄蒂皮瓣IRI過程中所發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康成年SD大鼠36只，雌雄不限，體質量（250±19）g，由江蘇大學實驗動物中心提供。隨機將大鼠分為CORM-2組和對照組，每組18只。單籠飼養，自由進食飲水，室溫控制在25℃左右，濕度40%～60%。

1.2 皮瓣IRI模型制備

術前1 d，8%Na2S溶液脫毛，備皮范圍4～10 cm，實驗前一夜禁食。腹腔注射10%水合氯醛（4 mL／kg）麻醉，大鼠俯臥位固定。將蒂設計在模型尾側，蒂長寬為1.5 cm×1 cm，瓣長寬為6 cm×1.5 cm，手術達深筋膜，掀起皮瓣組織后，在皮瓣基底鋪一次性潔凈無菌保鮮膜，3-0手術縫合線原位縫合。

1.3 給藥方法

CORM-2組：術后即刻尾靜脈注射CORM-2（8 mg／kg）；對照組：尾靜脈注射等量的生理鹽水。兩組每隔24 h給藥1次，直到術后第7天。

1.4 觀察指標

1.4.1 皮瓣組織NF-κB活性的檢測 術后24 h取大鼠皮瓣中部組織，按照組織勻漿方法進行勻漿和離心，提取核蛋白，采用蛋白印跡法檢測NF-κB的活性。試劑為兔NF-κB p65多抗（美國Santa Cruz公司）。

1.4.2 皮瓣組織丙二醛含量和SOD活性檢測 術后第3、5、7天分別取CORM-2組和對照組皮瓣中部組織，勻漿取上清液，根據1∶4比例用生理鹽水進行稀釋，得到2%的組織勻漿。應用硫代巴比妥酸法檢測皮瓣組織丙二醛的含量，應用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD的活性。

1.4.3 血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-6水平的測定 術后第3、5、7天從大鼠心臟取血，采用雙抗體夾心酶聯免疫法（ELISA）檢測血清TNF-α和IL-6含量，具體步驟參考ELISA試劑盒（南京建成生物技術公司）說明書。

1.4.4 組織學觀察 術后第3、5、7天分別取CORM-2組和對照組皮瓣的蒂部0.5 cm×0.2 cm全厚皮瓣組織，以4%低聚甲醛固定，石蠟包埋切片、HE染色。

1.4.5 皮瓣成活率 術后第7天采用高清數碼相機對皮瓣存活情況進行拍照，圖像輸入計算機，用Image-Pro P1us 7.0圖像分析軟件分析，并計算成活率。成活率＝存活面積／皮瓣總面積×100%。

1.5 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行分析。兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 皮瓣組織NF-κB活性

蛋白質印跡檢測結果顯示，對照組大鼠皮瓣組織中NF-κB與β-肌動蛋白的比值為1.2±0.14；尾靜脈注射CORM-2干預后，大鼠皮瓣組織中NF-κB與β-肌動蛋白的比值為0.5±0.07，明顯低于對照組（t＝6.083，P＜0.01）。見圖1。

圖1 兩組大鼠皮瓣組織中NF-κB的表達

2.2 皮瓣組織丙二醛含量、SOD活性

與對照組比較，在第3、第5、第7天各時間點CORM-2組大鼠皮瓣組織丙二醛含量明顯下降（P＜0.01），而SOD活性明顯升高（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組大鼠皮瓣組織各時間點SOD活性和丙二醛含量的比較 ±s，n＝18

表1 兩組大鼠皮瓣組織各時間點SOD活性和丙二醛含量的比較 ±s，n＝18

分組 SOD（nmol／kg ） 丙二醛（nmol／kg ）第3天 第5天 第7天 第3天 第5天 第7天7 4.67±0.64 2.99±0.72 CORM-2組 56.93±3.70 47.22±6.32 72.72±2.28 4.15±0.36 3.47±0.36 2.25±0.16 t值對照組 44.89±3.51 33.20±5.40 53.73±11.74 5.90±0.2 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 7.952 6.269 6.012 6.369 7.698 6.874 P值

2.3 血清IL-6和TNF-α含量的變化

與對照組比較，CORM-2組大鼠各時間點血清TNF-α和IL-6含量均明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組大鼠各時間點血清IL-6和TNF-α含量的變化 ±s，n＝18

表2 兩組大鼠各時間點血清IL-6和TNF-α含量的變化 ±s，n＝18

分組 IL-6（nmol／kg ）TNF-α（nmol／kg ）第3天 第5天 第7天 第3天 第5天 第7天64.56±3.92 144.62±3.87 CORM-2組 0.84±0.08 0.62±0.07 0.57±0.04 140.77±3.36 111.80±4.96 99.10±5.74 t值對照組 1.05±0.09 0.94±0.09 0.89±0.07 189.84±5.68 1 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 7.063 7.986 6.996 10.95 11.58 9.698 P值

2.4 皮瓣組織的病理形態

術后第3天，CORM-2組大鼠皮瓣蒂部未見明顯變化，無明顯腫脹，可見少許新生毛細血管；對照組皮瓣蒂部表皮下組織略微水腫，可見中性粒細胞浸潤，毛細血管增生不明顯。術后第5天，CORM-2組大鼠皮瓣蒂部新生毛細血管數量明顯增多；對照組皮瓣蒂部水腫不明顯，可見少量中性粒細胞浸潤，未見明顯的毛細血管增生。術后第7天，CORM-2組可見豐富的毛細血管增生，明顯多于對照組，且可見少數血管管徑變大，蒂部充血。見圖2。

圖2 兩組大鼠術后不同時間的皮瓣組織病理形態（HE染色×200）

2.5 皮瓣存活率

術后第7天，記錄CORM-2和對照組各自大鼠皮瓣的成活情況。結果顯示，對照組皮瓣平均存活率為52.72%，CORM-2組皮瓣平均存活率為77.22%，CORM-2組平均存活率較對照組提高24.50%，兩組間差異有統計學意義（t＝7.062，P＜0.01）。

3 討論

3.1 窄蒂皮瓣IRI模型的選擇

大鼠容易飼養且手術操作和術后處理較為簡單，因此常作為皮瓣實驗研究的動物模型。根據王法剛等［7］對大鼠背部血流分布和實驗研究分析，我們選擇大鼠背部的中心線為皮瓣的軸線，將蒂部放在尾側的皮瓣模型更穩定可靠。趙天蘭等［2－3］證實，一定長寬比的狹長窄蒂所能攜帶的任意皮瓣成活面積有其最大值，超過限制范圍，皮瓣遠端即會存在血運障礙。故本實驗模型采用大鼠背部中心線作為皮瓣軸線，窄蒂位于尾側；選擇的蒂長寬比為1.5 cm∶1 cm，瓣長寬比為6 cm∶1.5 cm，缺血隨意皮瓣模型穩定。

3.2 CORM-2對大鼠隨意窄蒂皮瓣IRI的保護作用

3.2.1 CORM-2能改善皮瓣蒂部血供 隨意窄蒂皮瓣術后，首先對皮瓣成活造成最大影響的就是血供。研究顯示皮瓣成活的長度與皮瓣內的血流灌注壓密切相關［8］。由于本實驗是通過創底鋪置保鮮膜干預創底創緣的血供，因此蒂部的血供改善在皮瓣的成活過程中尤為關鍵。我們在術后第3、5、7天取皮瓣蒂部組織切片進行HE染色，光鏡下發現CORM-2組皮瓣蒂部肉芽組織開始增生，新生毛細血管明顯，且可見少數血管管徑變大，蒂部充血量豐富。對照組較CORM-2組毛細血管數量少，少數亦表現出輕微玻璃樣壞死。同時，我們在切取蒂部組織時發現CORM-2組蒂部切開時有明顯出血，色澤鮮艷。而對照組只有少數樣本出血，且出血量明顯少于CORM-2組。這一現象與光鏡下結果相符。在術后第7天，經圖像分析數碼相機記錄的兩組皮瓣成活情況，顯示CORM-2組平均存活率較對照組明顯提高。

結果證明CORM-2在隨意窄蒂皮瓣缺血損傷過程中參與皮瓣血管形成、血管擴張、血液循環調節，增加蒂部血流，提高皮瓣內血流灌注壓，血液走行路徑得到延長、分布面積擴大，從而改變了皮瓣遠端血供狀況，縮小遠端壞死比例，使皮瓣的成活率得到明顯提高。

3.2.2 CORM-2具有抗氧化應激反應的作用 郭樹忠等［9］的研究表明，隨意皮瓣手術后缺血 再灌注時，皮瓣組織產生大量的自由基，進而對皮瓣造成損傷，并發現皮瓣組織中的SOD活性和丙二醛含量之間存在負相關。在皮瓣IRI過程中，自由基生成逐漸增加，從而導致丙二醛含量隨之增加。由于生成的自由基對SOD有攻擊性，致SOD的活性下降，導致組織內的自由基不能得到有效清除。而自由基的堆積會放大脂質過氧化反應，使丙二醛含量進一步升高，從而形成了一種惡性循環。SOD失活即意味著其對皮瓣組織的保護作用喪失。通過局部進行外源性SOD灌注能明顯提高皮瓣的成活率。由此表明，SOD對皮瓣組織在缺血再灌注時所產生的大量自由基的清除是至關重要的。杜佳梅等［10］以及周力純等［11］的研究也證實了皮瓣術后組織自由基明顯增多，氧化應激反應程度升高，且對皮瓣的成活情況有明顯影響。

我們在術后第3、5、7天分別取CORM-2組和對照組皮瓣中部組織進行勻漿，檢測組織中抗氧化酶SOD和脂質過氧化產物丙二醛，以明確反映機體在術后抗氧化能力及氧化應激程度，從而間接反映兩組皮瓣損傷程度的區別。實驗結果顯示，與對照組比較，CORM-2組大鼠皮瓣中的丙二醛含量明顯降低，而SOD活性顯著升高，表明CORM-2在窄蒂皮瓣術后能有效對抗缺血 再灌注時產生的氧化應激，減輕自由基對皮瓣的損傷，因此對皮瓣具有保護作用。

3.2.3 CORM-2的抗炎癥反應作用 大量研究表明，再灌注時炎癥的激發和級聯反應促進了繼發性損害，這是皮瓣缺血壞死的又一重要原因。TNF-α是機體內一種重要的促炎癥細胞因子，IL-6是機體對感染和組織損傷所引起反應的主要介質。創傷后巨噬細胞分泌大量TNF-α和IL-6，參與機體炎癥反應。國內外相關研究表明，在創傷等應激狀態下，機體TNF-α和IL-6水平明顯升高［12－13］，導致多種炎癥因子瀑布式釋放，造成血管內皮功能障礙。

細胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達量在缺血損傷時明顯上調，再灌注時白細胞表面的整合素與其結合，導致血管內皮細胞表面大量的白細胞黏附聚集，釋放一系列的炎癥因子和自由基，損傷血管內皮，加重IRI［14－15］。研究顯示NF-κB是一種信號傳導途徑中的核內反應信號分子，可誘導細胞因子、內皮細胞黏附分子、單核細胞趨化因子的轉錄合成，促進炎性信號的級聯擴大，最終導致機體的多器官損傷。大鼠皮瓣在掀起后，就產生了缺血 再灌注損傷，機體相應釋放大量的炎癥介質，產生一系列炎癥反應，從而造成對皮瓣組織的直接損害。實驗結果顯示術后24 h CORM-2組皮瓣組織NF-κB表達明顯降低，且術后第3、5、7天TNF-α和IL-6血清水平明顯降低（P＜0.01），說明CORM-2在大鼠窄蒂皮瓣IRI模型中對炎癥反應起到重要的抑制作用，可減輕IRI對皮瓣組織的損傷。本課題組前期在膿毒癥實驗研究中證實CORM-2具有抑制NF-κB活性和內皮細胞ICAM-1表達的作用［16］。因此，我們推測CORM-2在大鼠皮瓣IRI過程中發揮了同樣的調控作用，抑制NF-κB的表達與活化，繼而下調內皮細胞ICAM-1的表達，有效減少炎癥因子的釋放，降低炎癥反應對組織的損傷；抑制中性粒細胞、血小板在血管內皮上的黏附聚集，并減少自由基的釋放，對血管內皮起到一定的保護作用，促進皮瓣組織的成活。

綜上所述，在大鼠皮瓣IRI中，CORM-2釋放的CO作為一種血管調節因子，具有擴張血管、促進新生毛細血管形成、增加血供的作用；CO可明顯抑制NF-κB活性，減少前炎癥細胞因子的釋放，減輕白細胞對組織和血管內皮的浸潤黏附，對血管內皮起到間接保護作用；CO在產生抗炎反應的同時，減少了炎性細胞釋放自由基，進而避免了IRI過程中脂質過氧化反應的放大，對組織起到保護作用。

［1］趙天蘭，程新德，熊紹虎，等.窄蒂皮側頜頸部皮瓣的解剖與臨床應用［J］.中華顯微外科雜志，2002，25（4）：201－202.

［2］趙天蘭，余道江，吳浩榮，等.一定長寬比狹長窄蒂與任意皮瓣成活面積關系的實驗研究［J］.中華顯微外科雜志，2009，32（5）：393－395.

［3］趙天蘭，余道江，吳浩榮，等.豬狹長窄蒂隨意型皮瓣蒂部不同長寬比例與成活面積關系的研究［J］.中華整形外科雜志，2011，27（1）：40－43.

［4］Zhang X，Shan P，Alam J，et al.Carbonmonoxidemodulates Fas／Fas ligand，caspases，and Bcl-2 family proteins via the p38αmitogen-activated protein kinase pathway during ischemia-reperfusion lung injury［J］.J Biol Chem，2003，278（24）：22061－22070.

［5］Song R，Kubo M，Morse D，et al.Carbon monoxide induces cytoprotection in ratorthotopic lung transplantation via anti-inflammatory and anti-apoptotic effects［J］.Am JPathol，2003，163（1）：231－242.

［6］Nakao A，Choi AM，Murase N.Protective effect of carbon monoxide in transplantation［J］.J Cell Mol Med，2006，10（3）：650－671.

［7］王法剛，薛文君.皮下注射血管內皮生長因子基因提高大鼠背部隨意皮瓣活力的實驗研究［J］.中華整形外科雜志，2002，18（3）：157－159.

［8］成紅兵，侍德.皮瓣血供的實驗研究［J］.南通大學學報：醫學版，1984，4（1）：16－19.

［9］郭樹忠，汪良能，魯開化.自由基對缺血游離皮瓣的損傷和超氧化物歧化酶抗損傷作用的實驗研究［J］.中國修復重建外科雜志，1995，9（2）：104－107.

［10］杜佳梅，金建學，張松林，等.一氧化氮對任意型皮瓣成活的影響［J］.中華整形外科雜志，2002，18（6）：353－356.

［11］周力純，陜聲國，張瑞蓮，等.一氧化氮對任意型皮瓣成活的實驗研究［J］.中華整形外科雜志，2004，20（1）：38－40.

［12］InajiM，Tomita H，Tone O，et al.Chronological changes of perihematomal edema of human intracerebral hematoma［J］.Acta Neurochir Suppl，2003，86：445－448.

［13］Inagawa T，Ohhayshi N，Takechi A，et al.Primary intracerebral hemorrhage in lzumo City，Japan：incidence rates and outcome in relation to the site of hemorrhage［J］.Neurosurgery，2003，53（6）：1283－1297.

［14］del Zoppo GJ.Microvascular responses to cerebral ischemia／inflammation［J］.Ann N Y Acad Sci，1997，823：132－147.

［15］Stannimirovic D，Shapiro A，Wong J，et al.The induction of ICAM-1 in human cerebralbromivascular endothelial cells（HCEC）by ischemia-like conditions promotes enhanced neutrophil／HCEC adhesion［J］.J Neuroimmunol，1997，76（1／2）：193－205.

［16］孫炳偉，陳曦，Kazuhiro Katada，等.外源性一氧化碳釋放分子抑制膿毒癥炎癥反應的實驗研究［J］.江蘇大學學報：醫學版，2008，18（5）：369－377.

Protection of CO-releasing molecules-2 against the random narrow pedicle skin flap w ith ischem ia-reperfusion injury in rats

GAO Liang，TAINing-zheng
（Department of Burns and Plastic Surgery，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To observe the effect of CO-releasingmolecules-2（CORM-2）on the random narrow pedicle skin flap in the SD ratswith ischemia-reperfusion injury（IRI），and discuss the possiblemechanism.M ethods：Established IRImodels of random narrow pedicle skin flap in rats.A total of 36 SD rats were divided into two groups at random：CORM-2 group，models of random narrow pedicle skin flap and treated by CORM-2；NS group，models of random narrow pedicle skin flap and treated by normal saline（NS）.Test the activity of NF-κB byWestern blotting.The content ofmalonaldehyde（MDA）in tissue of skin flap was detected by phenobarbitone acid；the activity of superoxide dismutase（SOD）in tissue of skin flap was detected by xanthine oxidase；the level of IL-6 and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in blood serum was detected by ELISA；pathological changes were observed with lightmicroscope in the 3rd，5th，7th day after operation；survival rate of skin flap was the average survival length of skin flap deciding practical length of skin flap.Results：①The skin flap uncovered by the 3rd，5th，7th day，compared with NSgroup，the content of MDA in the skin flap of CORM-2 group lower（P＜0.01），the activity of SOD significantly increased（P＜0.01）.②The skin flap uncovered by 3rd，5th，7th day，compared with NS group，the level of IL-6 and TNF-αin blood serum lower（P＜0.01）.③Histopathology showed that abundant capillary were no-ticed by application of CORM-2.④CORM-2 can effectively restrain the NF-κB activation in random narrow pedicle skin flap model.⑤The skin flap was uncovered by the 7th day，compared with NSgroup，survival rate of skin flap of CORM-2 group significantly higher（P＜0.01）.Conclusion：CORM-2 effectively reduced the narrow pedicle skin flap of ratswith IRI，and improved the survival rate of flap.

CO-releasing molecule-2；random narrow pedicle skin flap；ischemia reperfusion injury；malonaldehyde；superoxide dismutase；IL-6；tumor necrosis factor-α；NF-κB

R965.1

A

1671－7783（2014）04－0307－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140034

國家自然科學基金資助項目（30772256，81272148）

高亮（1988—），男，碩士研究生；邰寧正（通訊作者），副主任醫師，碩士生導師，E-mail：710204914＠qq.com

2014－01－21 ［編輯］陳海林