水凝膠型防齲基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT經黏膜途徑免疫兔的實驗研究

管曉燕，李 敏，劉建國，李 虎，白國輝，肖茜文，張丁文，董競男

(1.遵義醫學院 口腔學院，貴州 遵義 563099；2.貴州省高等學?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室，貴州 遵義 563099)

齲病是由細菌引起的牙體硬組織的慢性感染性疾病，鏈球菌屬的變異鏈球菌是重要的致齲菌，葡萄基轉移酶(Glucosyltransferase, GTF)是其重要的毒力因子之一，也是主要的免疫抗原[1]。GTF的催化活性區(Catalytic, CAT)可以催化蔗糖水解酶的活性，使其產生葡聚糖，對變異鏈球菌在牙面的附著和齲病發生有著重要的作用。研究已經證實，以GTF和GTF/ CAT為抗原免疫動物能夠有效地控制齲病發生。為了提高基因疫苗的免疫原性，增強免疫應答，更好地保護宿主，選擇具有緩釋功能的遞送系統搭載基因疫苗已經成為研究熱點，緩釋系統能夠保護疫苗本身的性質不受破壞，為疫苗發揮作用提供了有利環境。課題組前期已成功構建了防齲基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT，制備了以溫敏型生物降解水凝膠PLGA-PEG-PLGA作為緩釋系統的水凝膠型防齲基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT[2-3]。本實驗將該水凝膠型防齲基因疫苗經口服和鼻腔黏膜滴注兩種途徑免疫新西蘭大白兔，觀察特異性抗體的動態變化及其在動物免疫部位的蛋白表達，分析水凝膠型防齲基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT的免疫原性，為后續實驗提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔20只，雄性，普通級(購于第三軍醫大學野戰外科研究所醫學實驗動物中心，許可證號：SCXK(渝)20070005)。

1.2 主要試劑及主要儀器 PLGA-PEG-PLGA(由電子科技大學微電子與固體電子學院郝建原教授提供)；鼠抗GTF多克隆抗體(課題小組前期制備)；辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG (美國Amresco公司)；辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgA(美國Genet公司)；SP法免疫組化試劑盒(博士德公司)；生物素標記的第二抗體(博奧生物公司)；變異鏈球菌GTF(課題小組前期分離純化)；重組質粒pVAX1-gtfB/CAT(課題小組前期構建)；空載體質粒pVAX1(美國Invitogen公司)；酶聯免疫檢測儀(美國Instruments.Inc公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)，柱式質粒(大量)純化試劑盒(美國Omega公司)。

1.3 重組質粒pVAX1-gtfB/CAT和空載體質粒pVAX1的制備 采用柱式質粒(大量)純化試劑盒按說明書制備重組質粒pVAX1-gtfB/CAT和空載體質粒pVAX1。

1.4 疫苗制備[3]分別準確稱量200 μg重組質粒pVAX1-gtfB/CAT及空載質粒pVAX1與0.8 mL 20%水凝膠混合，恒溫振蕩器振蕩過夜(100 r/min)，備用。

1.5 動物分組與免疫 20只新西蘭大白兔隨機分為5組，每組4只。分別為：A組：pVAX1-gtfB/CAT口服組，B組： pVAX1-gtfB/CAT鼻腔黏膜滴注組，C組：空載體pVAX1質?？诜M，D組：空載體pVAX1+水凝膠口服組，G組：生理鹽水鼻腔黏膜滴注組。每間隔1周免疫1次，共3次。每次免疫質粒劑量為200 μg/只。

1.6 樣本采集 唾液樣本的收集：將2%的硝酸毛果蕓香堿按照0.2 mg/100g的比例，注射入動物頸部皮下，采集唾液，離心，收集上清液，備用。血液樣本的收集：將兔子固定在固定器上，靜脈采血，離心，收集血清，備用。于免疫前和免疫后第1、2、3、4、6、8、10、12、14、16周采集動物血液及唾液樣本。組織切片制備：第3次免疫后每組處死1只動物，取小腸黏膜和鼻腔黏膜組織，常規石蠟包埋。

1.7 特異性抗體的檢測 采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測特異性抗體水平。利用抗原包被緩沖液(PBS,pH9.6)將蛋白GTF稀釋成2.5 μg/mL包被96孔板，每孔100 μL；用3%BSA封閉各反應孔，每孔200 μL，37 ℃濕盒孵育，2 h后棄去封閉液，分別將稀釋后的唾液(1∶2)和血清(1∶80)加到酶標板的各反應孔中，每孔100 μL，用塑料保鮮膜封好微量酶標板，37 ℃濕盒孵育2 h；然后分別將辣根過氧化酶標記羊抗兔IgA(1∶1 250)和辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG(1∶4 000)加到酶標板各反應孔中，每孔100 μL，用塑料保鮮膜封好，37 ℃濕盒孵育2 h向各反應孔中加入TMB底物使用液，每孔100 μL，用塑料保鮮膜封好后，37 ℃濕盒中避光顯色25～30 min后，再向每孔加入50 μL終止液終止反應，利用酶標儀測定各反應孔OD450值。

1.8 目的蛋白表達的檢測 采用免疫組織化學染色SP法檢測目的蛋白的原位表達。將石蠟切片脫蠟；將載玻片放入盛有0.01M枸櫞酸鹽緩沖液的微波用塑料盒中放入微波爐中；洗片后每張切片加1滴3%過氧化氫去離子水，室溫孵育10 min后，每張切片加1滴正常非免疫動物血清，室溫放置15 min后，每張切片滴加(1∶50)的一抗(鼠抗GTF多克隆抗體：為本課題組前期制備)50 μL，4 ℃過夜；次日洗片后每張切片加1滴生物素標記的第二抗體，室溫10 min；洗片后每張切片滴加1滴鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，每張切片滴加30 μL DAB顯色，顯微鏡下控制染色，當組織或目標細胞陽性表達部位為深棕色或棕黃色時即可終止顯色，將片子沖洗脫水后封片。

2 結果

2.1 唾液中SIgA型抗GTF抗體水平 實驗組唾液中SIgA型抗GTF抗體水平在免疫后保持明顯上升趨勢，顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，第6周時達到最高峰，隨后開始下降?？诜M和鼻腔黏膜滴注組抗體水平變化趨勢無明顯差異，提示口服和鼻腔黏膜滴注免疫對SIgA型抗GTF抗體在唾液中的免疫效果基本相同(見圖1)。

圖1 唾液中SIgA型抗GTF抗體水平

2.2 血清中SIgA型抗GTF抗體水平 免疫后血清中SIgA型抗GTF抗體水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，在第3周至第12周保持相對較高水平?？诜M和鼻腔黏膜滴注組抗體水平有少許差異，但變化趨勢相似，提示口服和鼻腔黏膜滴注免疫對SIgA型抗GTF抗體在血清中的免疫效果基本相同(見圖2)。

圖2 血清中SIgA型抗GTF抗體水平

2.3 唾液中IgG型抗GTF抗體水平 免疫后各實驗組唾液中IgG型抗GTF抗體明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。第6周抗體水平最高，隨后抗體水平開始緩慢下降。在第6、8、10周時，口服組和鼻腔黏膜滴注組抗體水平有一定差異，口服組高于鼻腔黏膜滴注組(見圖3)。

圖3 唾液中IgG型抗GTF抗體水平

2.4 血清中IgG型抗GTF抗體水平 免疫后實驗組血清中IgG型抗GTF抗體水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。在第6、8、12、14周時，抗體水平有差異，但無統計學意義，不影響整體的變化趨勢。提示pVAX1-gtfB/CAT成功表達，使血清中IgG型抗GTF抗體水平變化明顯，效果顯著(見圖4)。

2.5 注射部位目的蛋白的表達 免疫組織化學檢測可見外源基因在口服組小腸黏膜的細胞胞漿內和鼻腔黏膜滴注組鼻黏膜上皮下方的固有層中表達(見圖5)。

A ：pVAX1-gtfB/CAT口服組目的蛋白在小腸黏膜上皮細胞胞漿中的陽性表達；B： pVAX1口服組(對照組)目的蛋白在小腸黏膜上皮細胞胞漿中的陰性表達；C：pVAX1-gtfB/CAT鼻腔黏膜滴注組目的蛋白在鼻腔黏膜固有層結締組織成纖維細胞胞漿中的陽性表達；D：pVAX1鼻腔黏膜滴注組(對照組)目的蛋白在鼻腔黏膜固有層結締組織成纖維細胞胞漿中的陰性表達。圖5 目的蛋白的原位表達情況(SP法，×200)

3 討論

水凝膠是在空間結構上呈三維網狀結構的一類高分子材料，具有獨特的吸水和良好的生物相容性、藥物釋放的可控性、生物粘附作用和可降解等新型遞送系統所具備的優點，目前在基因疫苗、功能性材料、組織工程等領域得到了廣泛的應用，尤其是在抗菌素、疫苗、避孕藥和激素等傳送藥物方面[4]。

水凝膠的最新發展方向是智能型水凝膠，包括溫度敏感型、pH 敏感型、溫度和pH雙重敏感型以及磁性響應型等[5]。溫度敏感性水凝膠高分子材料對于溫度的變化具有非常高的敏感度，該凝膠具有最低臨界共溶溫度，其溶脹與收縮性隨溫度變化并不是呈線性，而是在某一溫度下水凝膠的體積表現為突然的收縮和膨脹。具體表現為在較低溫度下溶脹度較高，在相對較高溫度下溶脹度比較低。許多研究表明，將此類水凝膠作為藥物的緩釋系統，在機體不同溫度進行可控性釋放方面的研究具有非常重要意義。孫佳麗等[6]用化學方法得到了水溶性良好，同時在37 ℃時水凝膠溶膠向凝膠轉變的時間小于10min的改性材料CS-PEG；經過體外釋藥實驗，發現該CS-mPEG水凝膠控釋作用較好，親水能力強，有助于保護蛋白活性不被破壞。吉秋霞等[7]制備CS-HTCC/GP溫敏水凝膠，通過檢測對牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和伴放線放線桿菌抑制作用，證實其不僅可作為藥物載體參與局部緩釋系統的組成， 同時可作為活性因子參與殺菌、抑菌，具有作為牙周局部用藥的潛力。本實驗所用的溫敏型可生物降解PLGA-PEG-PLGA水凝膠是三段嵌合共聚物形成的網狀體系，是利用材料空隙儲存藥物[4,8]。其在低于低臨界溶液溫度(Lower Critical Solution Temperature,LCST)時凝膠變為溶液相，高于該溫度時又由液相變為凝膠狀，可以在凝膠液相時同基因疫苗混勻形成一個穩定的緩釋體系，發揮緩釋作用，是比較理想的基因疫苗遞送系統。

口腔中抵抗齲病的抗體成分主要來源于黏膜免疫系統，如何使防齲疫苗有效激活黏膜免疫系統，產生高滴度的特異性SIgA是研制防齲疫苗的關鍵[9]。由于黏膜免疫操作簡單以及同時可誘導黏膜和系統免疫反應等優點[10]，目前多數防齲疫苗采用鼻腔滴注、口服、灌胃、扁桃體噴霧等黏膜途徑進行免疫[11]。田源等[12]將表達外源目的蛋白的轉基因番茄經口服途徑免疫兔后，有效地誘導了動物唾液和血液特異性抗體的產生。岳朝暉等[13]將防齲基因疫苗pcDNA3-PAc經鼻腔黏膜滴注途徑免疫BALB/c小鼠，有效地誘導了黏膜免疫應答和系統免疫應答。課題組前期利用溫敏性水凝膠搭載防齲基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT免疫SD大鼠，發現疫苗在大鼠體內可以起到緩釋作用，能夠有效地誘導動物產生特異性抗體，并在一段時間內維持較高水平。齲齒記分分析表明，能夠有效抑制SD大鼠齲齒的發生[3]。

本實驗利用該水凝膠型防齲疫苗經口服和鼻腔黏膜滴注兩種黏膜途徑免疫新西蘭大白兔，均有效地誘導動物產生特異性抗體，并且可以持續一段時間，提示該疫苗具有較好的免疫原性，能夠誘導機體產生系統免疫和黏膜免疫應答,兩種黏膜免疫途徑都可能是該疫苗的有效免疫途徑。

重組質粒pVAX1-gtfB/CAT經口服和鼻腔黏膜滴注2種途徑免疫新西蘭大白兔后，觀察到免疫部位目的蛋白的表達，說明質粒被攝取并經轉錄、翻譯等過程成功表達抗原蛋白分子。小腸黏膜的細胞胞漿中目的蛋白的表達可能與疫苗在M細胞中的定位吸收有關[14-15]。

水凝膠作為防齲疫苗的遞送系統，擁有其獨特的發展潛力，通過口服或者鼻腔黏膜滴注免疫，其緩釋作用能夠做到比較平穩的釋放藥物，達到一個長期的給藥過程。同時由于其良好的生物相容性，能較好的保護疫苗不被降解，從而提高藥物使用效率。但目前水凝膠的研究主要集中在制備工藝上，作為藥物控釋、傳輸的理論及應用研究還不夠深入，同時因為水凝膠力學性能差等方面的限制，要將水凝膠實際運用臨床還有待更加深入的研究，但作為口服防齲疫苗的搭載系統為齲病學者提供了新的研究方向。

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