食管鱗狀細胞癌組織中USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表達

郭艷麗，李穎霞，陳奎生，李晟磊，溫洪濤#

1)鄭州大學第一附屬醫院消化內科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院病理科 鄭州 450052

食管鱗狀細胞癌組織中USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表達

郭艷麗1)，李穎霞1)，陳奎生2)，李晟磊2)，溫洪濤1)#

1)鄭州大學第一附屬醫院消化內科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院病理科 鄭州 450052

#通訊作者，男，1968年2月生，博士，教授，研究方向：消化道腫瘤，E-mail：wenhongtao68@163.com

特異性泛素肽酶22；C-myc；Caspase-3；食管鱗狀細胞癌

目的：探討特異性泛素肽酶22(USP22)、C-myc和Caspase-3蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及臨床意義。方法采用免疫組化SP法檢測45例食管鱗狀細胞癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管組織中USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表達，分析三者與食管鱗狀細胞癌臨床病理學特征的關系。結果食管鱗狀細胞癌、癌旁不典型增生和正常食管組織中USP22、C-myc、Caspase-3蛋白的陽性表達率比較差異具有統計學意義(χ2=39.614、41.838和33.889，P<0.001)。食管鱗狀細胞癌組織中USP22、C-myc蛋白的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度及臨床分期有關(P<0.05)，Caspase-3蛋白的表達與腫瘤分化程度有關(P<0.05)；USP22蛋白與C-myc蛋白表達呈正關聯(rP=0.559,P<0.001)，兩者與Caspase-3蛋白表達呈負關聯(rP=-0.468和-0.477,P<0.001)。結論USP22、C-myc高表達和Caspase-3低表達可能與食管癌發生發展相關。

食管癌是消化系統常見惡性腫瘤之一，以鱗狀細胞癌多見，其發生是多階段、多因素、多基因共同作用的結果，研究其發病機制對食管癌的診斷及治療意義重大。特異性泛素肽酶22(ubiquitin-specific processingpeptidase 22，USP22)是一種去泛素化酶，也是新鑒定的腫瘤干細胞標志物之一，其在多種惡性腫瘤細胞中普遍高表達，但在食管癌組織中的表達情況國內尚無報告。C-myc是腫瘤干細胞因子相關信號傳導wnt通路重要成員之一，研究[1]表明其與USP22具有協同作用。Caspase-3作為細胞凋亡的最終執行者，其活化標志著凋亡進入不可逆階段[2]。該研究通過免疫組化方法檢測USP22、C-myc、Caspase-3蛋白在食管鱗狀細胞癌(食管鱗癌)組織中的表達，探討其在食管癌發生發展中的作用，為臨床診治及預后判斷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1標本來源選取鄭州大學第一附屬醫院2011年1月至12月手術切除的食管鱗癌組織標本45例，其中男28例，女17例；年齡 45～82歲，<60歲23例，≥60歲22例；高、中分化27例，低分化18例；全層浸潤(突破肌層至外膜)24例,未全層浸潤(未突破肌層)21例；有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移20例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期19例，Ⅲ、Ⅳ期26例。所有患者術前均未進行放化療，臨床資料完整。所有標本分別在癌組織、癌旁不典型增生組織(取自距離癌組織邊緣5 cm以內)和正常食管黏膜組織(取自手術切緣或癌組織邊緣5 cm以外)3個部位取材，甲醛固定，石蠟包埋、5 μm厚連續切片,均經HE染色病理診斷證實。

1.2USP22、C-myc、Caspase-3蛋白表達的檢測采用免疫組化SP法。兔抗人USP22多克隆抗體(稀釋150倍使用)購自Abcam公司，兔抗人C-myc(稀釋150倍使用)和Caspase-3(稀釋100倍使用)多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。詳細步驟嚴格按SP試劑盒說明操作。試劑公司提供的已知陽性的乳腺組織作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3結果判定USP22及C-myc蛋白以細胞核內出現棕黃(褐)色顆粒為陽性染色 ，Caspase-3以細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性染色。高倍鏡下選取10個視野，每個視野至少計數100個細胞，分別對陽性細胞數及陽性細胞染色強度計分。陽性細胞數<5%為0分，6%～為1分，26%～為2分，51%～為3分，>75%為4分；陽性細胞染色強度：細胞無染色為0分，淡黃染色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩項評分相乘，總分<1分為陰性(-)，≥1分為陽性(+)。

1.4統計學處理應用SPSS 17.0分析，3種組織中USP22、C-myc、Caspase-3蛋白表達的比較采用χ2檢驗；食管鱗癌組織中USP22與C-myc蛋白的表達，兩者與Caspase-3蛋白表達的關聯性采用Pearson等級相關分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3種組織中USP22、C-myc、Caspase-3蛋白的表達見圖1和表1?？梢钥闯?，從正常組織、不典型增生組織到食管鱗癌組織，USP22、C-myc蛋白的表達依次增強，Caspase-3蛋白的表達逐漸降低。

圖1 3種組織中USP22(1)、C-myc(2)和Caspase-3(3)蛋白的表達(SP，×40)

表1 不同食管組織中USP22、C-myc及Caspase-3蛋白的表達陽性例數(%)

各組間兩兩比較,P均<0.05。

2.2USP22、C-myc和Caspase-3蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系見表2。USP22、C-myc蛋白的表達與腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、臨床分期等有關，與患者年齡、性別等無關；Caspase-3蛋白的表達僅與腫瘤分化程度有關，與年齡、性別、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期等均無關。

表2 USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系 陽性例數(%)

續表2

2.3食管鱗癌組織中USP22、C-myc及Caspase-3蛋白表達的關聯性USP22與C-myc表達呈正關聯，兩者均與Caspase-3表達呈負關聯。見表3～5。

表3 食管鱗癌組織中USP22和C-myc蛋白表達的關聯性 例

χ2=20.417，rP=0.559,P<0.001。

表4 食管鱗癌組織中USP22和Caspase-3蛋白表達的關聯性 例

χ2=12.598，rP=-0.468,P<0.001。

表5 食管鱗癌組織中C-myc和Caspase-3蛋白表達的關聯性 例

χ2=10.900，rP=-0.477,P<0.001。

3 討論

食管癌是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一，作為食管癌的高發及高死亡區,我國每年因食管癌死亡的人數約為15萬,約占全部惡性腫瘤死亡人數的1/4，早發現、早治療對食管癌的預后意義重大[3]。隨著科技的發展，腫瘤相關機制的研究日益清晰，分子靶向治療亦在食管癌治療中嶄露頭角。如何通過分子生物學手段，尋找易感基因，提高食管癌的早期診斷率及改善中晚期食管癌的治療療效已成為目前食管癌研究的主要方向。

原癌基因USP22 定位于17號染色體，是一種去泛素化肽酶，參與組蛋白去泛素化、乙?；M而參與 hSAGA復合物所調節的基因轉錄與表達等[4]。其與BMI-1、Cyclin B1等11個基因一起被稱為癌死亡標簽，在腫瘤的形成、侵襲生長、轉移及化療耐藥等方面具有明確作用，且發揮廣泛的生理作用，如調節細胞生長發育、細胞周期、細胞信號轉導等[5-6]，其異常表達與腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移和治療、預后等密切相關。研究表明USP22可能參與C-myc、P53介導的下游靶基因轉錄。Zhang等[7]發現下調USP22，可抑制myc介導的靶基因JPO1、ODC、CAD、Cyclin D2和MTA1等的轉錄，而在沉默USP22后, P53調控的靶基因p21、PIG3 和PUMA的表達也下調。Atanassov等[8]研究發現，USP22通過對端粒 DNA 結合蛋白(TRF1)去泛素化作用調節端粒動態平衡。該研究結果顯示：USP22蛋白在食管正常組織、癌旁不典型增生組織、癌組織中的陽性表達率逐漸升高，其表達與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期等有關。這與Li等[9]研究一致，提示USP22的過表達使腫瘤易于發生發展、侵襲、轉移、復發，是評價腫瘤分級，判斷預后的指標之一。

C-myc屬于myc癌基因家族，是多條信號轉導途徑的下游靶點，其激活是腫瘤發生的起始事件之一。C-myc通過與Ras、Sis、Fos等偶聯激活、抑制Cyclin E活性、激活hTERT表達等多種途徑導致腫瘤形成；通過抑制P21、P27等抑癌基因可使腫瘤細胞增殖能力增強，更易發生侵襲轉移。該研究發現，食管正常組織、癌旁不典型增生組織和食管鱗癌組織中C-myc的陽性表達率逐漸升高，其表達與腫瘤的浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、臨床分期等相關。這一結論與Wang等[10]的研究一致，與Gomes等[11]的結果不一致，原因有待進一步研究。

Caspase-3是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，其激活后產生激活型Caspase-3，能使眾多與細胞周期、細胞結構及DNA修復等相關的蛋白或激酶失活，從而使細胞發生凋亡[12]，在死亡受體通路及線粒體通路等誘導的凋亡過程中扮演重要角色。腫瘤的形成與凋亡障礙密切相關，Caspase-3在腫瘤細胞中表達情況的研究成為腫瘤分子生物學研究的熱點領域。Caspase-3活性可作為評價腫瘤治療反應的生物標志物，探究增加或抑制Caspase-3活性的因素在腫瘤病因學及防治學研究方面具有重要作用。Jiang等[13]研究表明Caspase-3在中國食管癌高發區食管癌中表達升高，且與細胞分化程度、浸潤深度及臨床分期等相關。王克文等[14]研究表明食管癌組織中Caspase-3表達明顯低于正常食管組織，表達程度與腫瘤的分化程度相關，與腫瘤的浸潤深度等臨床特征均無相關性，與該研究結論一致。亦有研究[15]表明食管癌中Caspase-3表達低于正常組織，且表達率與癌組織浸潤程度、淋巴結轉移等相關。這些結論差異很大，表明Caspase-3具體機制尚未完全清楚,需進一步研究。

周英妹等[16]研究發現USP22與C-myc存在密切關系,耗竭細胞的USP22可阻止C-myc工作,使其所致癌細胞的侵入性生長停止,C-myc激活的基因轉錄過程需要USP22,USP22是一個完整轉錄過程的控制者。該研究還發現，USP22與C-myc表達呈正相關，與Caspase-3表達呈負相關，前兩者高表達標志著腫瘤預后不良，Caspase-3的活性則可以成為腫瘤治療反應的預測信號。

綜上所述，該實驗通過研究三者在腫瘤細胞的表達及其關系，希望為食管癌診斷、治療、預后判定等提供新的切入點。

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[8]Atanassov BS, Evrard YA,Multani AS,et al. Gcn5 and SAGA regulate shelterin protein turnover and telomere maintenance[J]. Mol Cell, 2009, 35(3): 352

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(2013-10-13收稿 責任編輯李沛寰)

Expressions of USP22,C-myc and Caspase-3 proteins in esophageal squamous carcinoma

GUOYanli1),LIYingxia1),CHENKuisheng2),LIShenglei2),WENHongtao1)

1)DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

2)DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

ubiquitin-specific processingpeptidase 22;C-myc;Caspase-3;esophageal squamous cell carcinoma

Aim: To investigate the expression and clinical significance of USP22, C-myc and Caspase-3 proteins in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC). Methods: SP method of immunohistochemical was used to examine the expressions of USP22,C-myc and Caspase-3 proteins in 45 cases of ESCC,the atypical hyperplasia and normal esophageal tissues. Results: The positive expression rates of USP22,C-myc and Caspase-3 proteins in 45 cases of ESCC were 60.00%,66.67%,31.11%, respectively. There were significant differences between ESCC,the atypical hyperplasia tissues and normal esophageal mucosa(χ2=39.614,41.838 and 33.889，P<0.001)；There was relationship in the expression intensity of USP22 ,C-myc proteins and the differentiation grade of carcinoma, invasion,lymph node metastasis and clinical stages(P<0.05),The expressive intensity of Caspase-3 protein was related with the differentiation grade of carcinoma merely(P<0.05)；The expression level of USP22 was positively correlated with that of C-myc(rP=0.559,P<0.001)，both of them was negatively correlated with that of Caspase-3(rP=-0.468 and -0.477,P<0.001). Conclusion: The high level of USP22 and low level of C-myc might be necessary in the development and evolution of ESCC.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.003

R735.1