血管緊張素Ⅱ對小鼠骨髓間充質干細胞中ERK1/2和NF-κB信號途徑介導的炎癥反應的影響*

武俊芳，牛 杰，李曉鵬，張芬熙，范文艷，李穎虹，郭志剛

1)新鄉醫學院形態學實驗室 新鄉 453003 2)新鄉醫學院第三附屬醫院眼科 新鄉 453003 3)新鄉醫學院三全學院解剖學教研室 新鄉 453003 4) 新鄉醫學院干細胞與生物治療研究中心 新鄉 453003

血管緊張素Ⅱ對小鼠骨髓間充質干細胞中ERK1/2和NF-κB信號途徑介導的炎癥反應的影響*

武俊芳1)，牛 杰1)，李曉鵬2)，張芬熙3,4)#，范文艷1)，李穎虹1)，郭志剛1)

1)新鄉醫學院形態學實驗室 新鄉 453003 2)新鄉醫學院第三附屬醫院眼科 新鄉 453003 3)新鄉醫學院三全學院解剖學教研室 新鄉 453003 4) 新鄉醫學院干細胞與生物治療研究中心 新鄉 453003

#通訊作者，女，1978年8月生，碩士，講師，研究方向：干細胞，E-mail:fxzhang0824@gmail.com

血管緊張素Ⅱ；骨髓間充質干細胞；ERK1/2；NF-κB；炎癥反應；小鼠

目的：研究血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)對小鼠骨髓間充質干細胞(bmMSC)炎癥反應的影響。方法分別采用0、10-8、10-7、10-6和10-5mol/L Ang Ⅱ體外誘導培養bmMSC 12 h，然后應用ELISA法檢測細胞TNF-α和IL-6的分泌水平，RT-PCR法檢測細胞TNF-α和IL-6 mRNA的表達水平, Western blot法檢測細胞中ERK1/2和NF-κB-P65蛋白磷酸化程度。結果5組bmMSC TNF-α和IL-6分泌水平、mRNA表達水平，ERK1、ERK2和NF-κB-P65蛋白磷酸化程度差異均有統計學意義(F=34.562、53.940、24.622、30.208、96.129、106.293和24.752，P<0.001)。與0 mol/L Ang Ⅱ組比較，10-8、10-7、10-6和10-5mol/L Ang Ⅱ組細胞TNF-α和IL-6分泌水平升高(P<0.05)，TNF-α和IL-6 mRNA表達水平升高(P<0.05)，ERK1/2和NF-κB-P65磷酸化程度升高(P<0.05)，并且表現出一定的劑量依賴性(P<0.05)。結論Ang Ⅱ可通過活化ERK1/2和NF-κB信號途徑介導bmMSC的炎癥反應。

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell, bmMSC)是一類具有多向分化潛能的成體干細胞，在特定的環境下可向脂肪、成骨、軟骨、心肌和神經等多種功能細胞分化[1]。相關實驗[2-4]已經證明，bmMSC在體內外特定環境下均可向心肌細胞分化；bmMSC移植可改善心肌缺血再灌注后心臟的功能，減少瘢痕面積。通常，在移植前bmMSC須經生物或化學誘導劑誘導培養后才能確保有一定數量的細胞向心肌細胞分化，如血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)和5-氮雜胞嘧啶核苷(5-AZA)等[5-6]，其中AngⅡ為常用誘導劑之一。但是，AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAS)重要的功能性成分，可通過激活其特異性受體1(AT1R)和2(AT2R)活化RAS，在一系列生理和病理過程中發揮重要作用[5]。體內和體外實驗均證實AngⅡ可誘發炎癥反應[7]。Ang Ⅱ可增強NADPH氧化酶的活性，提高細胞內活性氧的含量,而活性氧可介導內皮細胞和心肌成纖維細胞等多種細胞的炎癥反應[7-8]。因此，AngⅡ對bmMSC的致炎反應值得關注。作者觀察了不同劑量Ang Ⅱ作用下小鼠bmMSC的炎癥反應情況，并對相關機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器總蛋白提取試劑盒購于普萊基因技術(北京)有限公司。Ang Ⅱ和2×PCR反應液購于美國Sigma公司。TNF-α和IL-6 ELISA檢測試劑盒購于美國R&D公司。DNase Ⅰ試劑盒、RNase試劑盒、SuperScript Ⅱ試劑盒和ProlongH Gold抗熒光淬滅劑購于美國Invitrogen公司。兔抗小鼠磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、ERK1/2、p-NF-κB-P65(p-P65)和NF-κB-P65(P65)一抗購于美國Cell Signaling公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗、FITC-CD90和PE-CD44等抗體均購于美國Abcam公司。SDS-PAGE凝膠試劑盒和PVDF購于鄭州寶生物科技有限公司。

1.2小鼠bmMSC的分離、培養及鑒定小鼠bmMSC的分離培養參考文獻[9]進行。采用常規免疫熒光染色技術檢測間充質干細胞特異性標記分子CD44和CD90的表達，染色時PE-CD44抗體和FITC-CD90抗體用胎牛血清稀釋200倍，用含DAPI的ProlongH Gold抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3實驗分組收集第3代bmMSC接種到12孔板(5×105個/孔)中常規培養12 h，再分別用含0、10-8、10-7、10-6和10-5mol/L Ang Ⅱ的培養基再培養12 h，然后進行相關指標的測定。 每組4個復孔。

1.4測定指標

1.4.1 bmMSC TNF-α和IL-6的分泌水平 收集各組細胞培養基，采用TNF-α和IL-6 ELISA檢測試劑盒檢測培養基中TNF-α和IL-6水平，具體操作按試劑盒說明進行。

1.4.2 bmMSC TNF-α和IL-6 mRNA的表達水平 收集各組細胞，應用RNase試劑盒提取總RNA,應用DNase Ⅰ試劑盒處理總RNA 10 min以消除DNA污染；應用SuperScript Ⅱ試劑盒對RNA進行反轉錄得cDNA，具體操作按各試劑盒說明進行。以cDNA為模板進行常規PCR。TNF-α引物序列：上游5’-CCGATGGGTTGTACCTTGTC-3’，下游5’-GGGCTGGGTAGAGAATGGAT-3’。 IL-6引物序列：上游5’-GAT GCTACCAAACTGGATATAATC-3’，下游5’-GGTCCT TAGCCACTCCTTCTGTG-3’。 內參β-actin引物序列：上游5’-TTCTTTGCAGCTCCTTCGTTGCCG-3’，下游5’-TGGATGGCTACGTACATGGCTGGG-3’。反應體系20 μL，包括2×PCR反應液10 μL，引物各0.3 μmol/L。反應條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s,72 ℃(TNF-α)或48 ℃(IL-6)或52 ℃(β-actin)30 s,34或37或32個循環;72 ℃延伸5 min;產物于4 ℃保存。產物經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色，用Bio-Rad凝膠成像儀(上海伯樂生命儀器公司)紫外光下記錄圖像，用Image J 圖像分析系統分析，計算各產物條帶的灰度值，以目的條帶與圖像背景灰度值之差表示目的條帶的絕對表達水平，以目的條帶與內參β-actin絕對表達水平之比表示目的基因mRNA的相對表達水平。

1.4.3 bmMSC ERK1/2和P65蛋白的磷酸化程度收集各組細胞，提取總蛋白，經12 g/L SDS-PAGE凝膠電泳分離，將蛋白轉到PVDF膜上,用體積分數5%胎牛血清室溫下封閉1 h，分別加入兔抗小鼠p-ERK1/2、ERK1/2、p-P65和P65一抗(均用TBST緩沖液稀釋1 000倍)，4 ℃搖床上過夜孵育，TBST緩沖液洗膜3次后加入HRP標記的山羊抗兔二抗(用TBST緩沖液稀釋10 000倍)，室溫搖床上孵育1 h，再用TBST緩沖液洗膜3次。ECL發光液發光并曝光底物。在Bio-Rad凝膠成像儀普通光源下記錄圖像，圖像處理同1.4.2。以磷酸化與非磷酸化蛋白表達水平的比值表示蛋白的磷酸化程度。

1.5統計學處理采用SPSS 11.5進行分析，應用單因素方差分析比較5組細胞TNF-α和IL-6的分泌水平和mRNA表達水平，以及ERK1/2、P65蛋白磷酸化程度，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1bmMSC的鑒定第3代分離所得的細胞呈典型的梭形或長梭形成纖維細胞形態，免疫熒光染色顯示細胞表達CD44和CD90(圖1)，提示分離所得的細胞為bmMSC。

圖1 小鼠bmMSC的鑒定

2.2 5組細胞TNF-α和IL-6分泌水平和mRNA表達水平的比較見表1、圖2和表2。與0 mol/L AngⅡ組比較，其他劑量AngⅡ組bmMSC的TNF-α和IL-6分泌水平和mRNA表達水平均顯著增加，且具有一定的劑量效應。

表1 5組細胞TNF-α和IL-6分泌水平的比較ng/L

組別nρ(TNF?α)ρ(IL?6)0mol/LAngⅡ組41425．823±110．014188．743±27．05910-8mol/LAngⅡ組41713．563±158．954257．633±46．26610-7mol/LAngⅡ組42115．373±363．179346．832±44．76110-6mol/LAngⅡ組42774．055±284．732622．865±76．59610-5mol/LAngⅡ組43472．180±382．332806．750±120．636F34．56253．940P<0．001<0．001

每個指標5組間兩兩比較，P均<0.05。

圖2 RT-PCR結果

1:0 mol/L AngⅡ組;2:10-8mol/L AngⅡ組;3:10-7mol/L AngⅡ組;4:10-6mol/L AngⅡ組;5:10-5mol/L AngⅡ組。

表2 5組細胞TNF-α和IL-6 mRNA表達水平的比較 %

每個指標5組間兩兩比較，P均<0.05。

2.3 5組細胞ERK1/2和P65蛋白磷酸化程度的比較Western blot檢測結果見圖3和表3?？梢钥闯?， Ang Ⅱ處理后bmMSC中ERK1/2和P65蛋白磷酸化程度均顯著增高，且具有一定的劑量效應。

圖3 Western blot結果

1：0 mol/L AngⅡ組;2:10-8mol/L AngⅡ組;3:10-7mol/L AngⅡ組;4:10-6mol/L AngⅡ組;5:10-5mol/L AngⅡ組。

表3 5組細胞ERK1/2和P65蛋白磷酸化程度的比較

每個指標5組間兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

間充質干細胞移植是目前臨床治療心肌梗死的重要手段之一。相關動物實驗研究[3]顯示，bmMSC移植可增強心肌梗死后小鼠心臟收縮功能，提高組織供血量，減輕心肌組織的纖維化。以往研究[5-6，10]顯示，經某些生物或化學誘導劑(如AngⅡ、5-AZA和轉化生長因子-β等)誘導培養后，bmMSC向心肌細胞轉化的效率可大大提高。其中，Ang Ⅱ為常用誘導劑之一，其可單獨應用，也可與其他誘導劑(如5-AZA)聯合應用誘導bmMSC向心肌細胞的分化[5，11]。但AngⅡ可在多種組織和細胞中誘發炎癥反應[7，12]。該研究作者也發現AngⅡ確實可誘發bmMSC的炎癥反應，表現為炎癥因子TNF-α和IL-6分泌水平和mRNA表達水平均明顯升高。而炎癥反應是影響間充質干細胞移植療效的重要因素，炎癥反應將降低間充質干細胞在宿主體內的存活率[13]。因此，在應用Ang Ⅱ誘導bmMSC向心肌細胞分化的過程中，其致炎作用應引起重視。

ERK1/2是細胞內重要的信號轉導系統, 其在生長、發育、分裂、分化和凋亡等多種細胞功能中發揮重要作用[14]。已有研究[14]顯示，ERK信號活化可促進多種炎癥細胞因子(包括MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8等)的表達。NF-κB為一個核轉錄因子家族，包括多個亞單位(如P65和P50等)，其通過磷酸化而獲得活化，進一步參與炎癥反應的調節[15]。此外，NF-κB也是ERK1信號途徑下游的分子，其活性受ERK1/2的調控；ERK1/2的活化可通過進一步激活NF-κB而促進炎癥反應的發生。該研究中，作者觀察到Ang Ⅱ誘導的小鼠bmMSC炎癥反應與ERK1/2和NF-κB信號途徑的活化有一定關系。

總之，該研究顯示AngⅡ可誘發小鼠bmMSC產生炎癥反應，這與ERK1/2和NF-κB信號途徑活化有關。在Ang Ⅱ單獨應用或與其他誘導劑聯合應用誘導小鼠bmMSC向心肌細胞分化過程中，應當注意其致炎作用。

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(2013-11-07收稿 責任編輯王 曼)

Effect of angiotensin Ⅱ on inflammatory responses of mouse bone marrow mesenchymal stem cell mediated by ERK1/2 and NF-κB pathways

WUJunfang1),NIUJie1)，LIXiaopeng2)，ZHANGFenxi3,4)，FANWenyan1)，LIYinghong1)，GUOZhigang1)

1)LaboratoryofMorphology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003 2)DepartmentofOphthalmology,theThirdAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003 3)DepartmentofAnatomy,SanquanCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003 4)StemCellandBiotheraphyTechnologyResearchCenter,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003

angiotensin Ⅱ;bone marrow mesenchymal stem cell;ERK1/2;NF-κB;inflammatory response;mouse

Aim: To study the effect of angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ) on inflammatory responses of mouse bone marrow mesenchymal stem cell(bmMSC). Methods: bmMSCs were treated with 0,10-8,10-7,10-6and 10-5mol/L Ang Ⅱ in vitro for 12 h. The secretion levels of TNF-α and IL-6 of these cells were measured using ELISA method. The expressions of TNF-α and IL-6 mRNA were measured by RT-PCR. The phosphorylated degree of ERK1/2 and NF-κB-P65 protein were measured by Western blot. Results: The differences in TNF-α and IL-6 secretion levels, TNF-α and IL-6 mRNA expressions, and the phosphorylated degree of ERK1/2 and NF-κB-P65 protein were significant among the five groups(F=34.562，53.940，24.622，30.208，96.129，106.293 and 24.752，P<0.001).Compared with those of the 0 mol/L Ang Ⅱ group, the secretion levels and mRNA expression of TNF-α and IL-6, and the phosphorylated degree of ERK1/2, NF-κB-P65 protein increased with the concentration of Ang Ⅱ increasing(P<0.05). Conclusion: Ang Ⅱ could mediate inflammatory responses in bmMSCs via activation of ERK1/2 and NF-κB pathways.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.006

*河南省教育廳自然科學基金資助項目 2010A310006

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