腦膠質瘤組織中Beclin-1的表達及與預后的關系*

王鳳偉，牛光明，張鵬遠，陶勝忠

鄭州大學第二附屬醫院神經外科 鄭州 450014

腦膠質瘤組織中Beclin-1的表達及與預后的關系*

王鳳偉，牛光明，張鵬遠，陶勝忠#

鄭州大學第二附屬醫院神經外科 鄭州 450014

#通訊作者，男，1968年10月生，博士，主任醫師，研究方向：腦膠質瘤的基礎與臨床，E-mail：tao2000zz@163.com

膠質瘤；Beclin-1；預后

目的：探討人腦膠質瘤組織中自噬相關基因Beclin-1的表達及與預后的關系。方法采用免疫組化SP法及RT-PCR技術檢測43例腦膠質瘤組織(包括Ⅰ級5例，Ⅱ級17例，Ⅲ級12例，Ⅳ級9例)及11例非瘤腦組織中Beclin-1蛋白和mRNA的表達，同時對隨訪資料進行Kaplan-Meier生存分析。結果非瘤腦組織，Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級腦膠質瘤組織中Beclin-1蛋白和mRNA的表達水平差異均有統計學意義(F=99.962和41.951，P均<0.001)。Ⅲ級、Ⅳ級腦膠質瘤組織中Beclin-1蛋白和mRNA的表達水平低于Ⅰ級、Ⅱ級腦膠質瘤組織和非瘤腦組織(P<0.05)，Ⅰ級、Ⅱ級腦膠質瘤組織中Beclin-1蛋白的表達水平低于非瘤腦組織(P<0.05)。43例患者隨訪到35例，以腦膠質瘤組織中Beclin-1蛋白表達水平的中位數為界限，將35例患者分成Beclin-1蛋白低表達組(16例)及高表達組(19例)，兩組的Kaplan-Meier生存曲線差異有統計學意義(χ2=4.962，P=0.026)，Beclin-1蛋白高表達組預后優于低表達組。結論Beclin-1可作為判斷人腦膠質瘤預后的新指標用于臨床。

腦膠質瘤是來源于神經上皮的、顱內最常見的惡性腫瘤，占顱內腫瘤的40%～50%，該腫瘤多呈浸潤性生長，手術不易全切，治療效果差。近些年尋找新的腦膠質瘤治療靶點成為重要的研究方向。自噬相關基因Beclin-1是酵母ATG6基因在哺乳動物中的同源物,是第一個被確認的自噬通路上的腫瘤抑制因子[1]。自噬通路中自噬相關基因的缺失在腫瘤發生及惡性演進過程中起著重要作用。據相關文獻[2-3]報道，自噬通路中Beclin-1基因的轉錄水平與腦膠質瘤的增殖與惡性轉化關系密切。作者分析了不同病理級別腦膠質瘤組織中Beclin-1的表達,并探討了其表達與患者預后的關系,進一步為腦膠質瘤的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1標本來源收集鄭州大學第二附屬醫院神經外科2009年7月至2011年8月手術切除的新鮮腦膠質瘤標本43例，標本均經病理確診,離體后0.5 h內轉至-80 ℃深低溫冰箱凍存?；颊呔鶠槌醢l病例，術前未接受放、化療等治療，其中男23例，女20例，年齡6～69(39.7±18.2)歲；星形膠質細胞瘤27例，少突膠質細胞瘤4例，室管膜細胞瘤5例，髓母細胞瘤4例，多形性膠質母細胞瘤2例，膠質肉瘤1例；按照2007年WHO神經腫瘤分類標準進行病理分級，其中Ⅰ級5例，Ⅱ級17例，Ⅲ級12例，Ⅳ級9例。另取11例來自同期收治的腦外傷或腦出血患者的非瘤腦組織標本作為對照，患者男7例，女4例，年齡(31.4±13.8)歲。手術切除后標本分成兩部分，一部分用于Beclin-1 mRNA的檢測，另一部分用于Beclin-1蛋白的檢測。

1.2主要試劑Beclin-1一抗、兔抗羊免疫熒光IgG二抗均購于美國Santa Cruz公司，逆轉錄PCR試劑盒(TaKaRa公司)和RNA試劑盒(包括Taq酶)購于北京賽百盛基因技術有限公司，Beclin-1 PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3非瘤腦組織及腦膠質瘤組織中Beclin-1蛋白的檢測采用免疫組化SP二步法。冰凍組織常規制片，滴加用PBS稀釋100倍的Beclin-1一抗，然后滴加生物素化二抗工作液。染色嚴格按照說明書進行操作。以已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。Beclin-1蛋白陽性信號定位于細胞質。利用Gel-Pro Analyzer 6.0圖像處理軟件進行圖像分析。每例切片在陽性反應區域選擇5個200倍視野，計算染色區域累積光密度值與圖片去除空白處的面積之比，取5個視野的平均值表示Beclin-1蛋白的表達水平。

1.4非瘤腦組織及腦膠質瘤組織中Beclin-1mRNA的檢測根據GenBank提供的相關序列，應用Primer 5.0軟件自行設計PCR引物，并通過NCBI/Primer-BLAST網進行引物同源性比較。GAPDH引物序列：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’(上游)和5’-GCCAGTAGAGGCAGGGAT-3’(下游),目的片段大小628 bp。Beclin-1引物序列：5’-GGCACAAT CAATAACTTCA-3’(上游)和5’-TGTCTCGCCTTTCT CAAC-3’ (下游)，目的片段大小318 bp。取凍存標本1 mm3，剪碎研磨，加入1 mL Trizol溶液裂解，按Trizol試劑盒說明書采用一步法提取總RNA,按逆轉錄試劑盒說明合成cDNA。以cDNA為模板，進行PCR。PCR反應條件：94 ℃30 s，55 ℃35 s，72 ℃30 s，共30個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統成像，利用Gel-Pro Analyzer 6.0軟件進行圖像分析，以目的條帶與內參GAPDH條帶累積光密度值的比值表示Beclin-1 mRNA的表達水平。

1.5預后分析采用門診隨訪或通訊聯系對43例患者進行術后隨訪，截止時間為2013年11月?？偵嫫诘挠嬎銖幕颊叩谝淮问中g時間開始到隨訪截止日期為止，或因其他疾病、復發轉移而死亡的日期為止，截尾值為0。

1.6統計學處理采用SPSS 17.0處理數據。不同組織中Beclin-1蛋白和mRNA表達水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗；分別對Beclin-1蛋白陽性及陰性表達患者繪制Kaplan-Meier生存曲線，并進行log-rank檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1非瘤腦組織及腦膠質瘤組織中Beclin-1蛋白和mRNA的表達見圖1、2和表1?？梢钥闯?，腦膠質瘤組織中Beclin-1蛋白和mRNA的表達水平均低于非瘤腦組織。

圖1 非瘤腦組織及腦膠質瘤組織中Beclin-1蛋白的表達(SP，×200)

圖2 非瘤腦組織及腦膠質瘤組織中Beclin-1 mRNA的表達

表1 非瘤和腦膠質瘤組織中Beclin-1蛋白和mRNA表達水平的比較

*:與非瘤腦組織比較，P<0.05；#：與腦膠質瘤Ⅰ、Ⅱ級組織比較，P<0.05；△：與腦膠質瘤Ⅲ級組織比較，P<0.05。

2.2腦膠質瘤組織中Beclin-1蛋白的表達與患者術后生存情況的關系43例患者獲隨訪35例。根據腦膠質瘤組織中Beclin-1蛋白表達水平的中位數0.036為界限，將35例患者分成Beclin-1蛋白低表達組(16例)及高表達組(19例)。分別對Beclin-1蛋白高及低表達患者繪制Kaplan-Meier生存曲線，見圖3。經log-rank檢驗，兩條生存曲線差異有統計學意義(χ2=4.962，P=0.026)，Beclin-1高表達組患者預后優于低表達組。

圖3 生存曲線

3 討論

Beclin-1是一個自噬相關基因，位于人染色體17q21，包括5’UTR 120 bp、1 353 bp的編碼區序列及3’UTR 625 bp序列。近年來自噬相關基因與腫瘤的研究引起了廣泛的關注，對于自噬相關基因在腫瘤中的表達及其在腫瘤演進中的作用，以及在不同腫瘤或同一器官不同類別腫瘤，甚至同一腫瘤的不同發展階段的表達，各研究結果報道不一致。相關研究報道食管鱗狀細胞癌[4]、胃癌[5]等腫瘤組織中Beclin-1的表達存在不同程度的降低，而肝癌[6]組織中卻呈現Beclin-1高表達，而有關人腦膠質瘤組織中Beclin-1表達狀況的相關研究罕見報道。Aita等[7]認為Beclin-1不僅參與自噬體的形成，誘導細胞凋亡，還可通過調節自噬活性在腫瘤演變過程中發揮重要作用。Niu等[8]發現應用RNA干擾及基因敲除技術使人類神經膠質瘤細胞株LN229、T98G和U251的Beclin-1基因沉默或表達缺失并沒有促進細胞的增殖，反而誘導了細胞的自噬。馬明明等[9]的研究結果表明，用神經節苷脂誘導惡性腦膠質瘤細胞U251 Beclin-1的表達上調導致細胞株自噬的同時，細胞增殖明顯受到抑制。上述相關研究提示，Beclin-1是一種具有雙重作用的自噬相關基因。

黃新等[10]分析了62 例不同病理級別的星形細胞瘤組織中Beclin-1的表達情況，結果顯示星形細胞瘤組織中Beclin-1蛋白表達隨腫瘤病理級別的升高而降低，生存期大于36個月者Beclin-1表達水平高于生存期小于36個月者。該研究發現，腦膠質瘤組織中Beclin-1蛋白和mRNA表達水平均低于非瘤腦組織，并且隨膠質瘤細胞分化程度的降低(病理級別的升高)而逐漸下降，表明Beclin-1基因表達下調可能是腦細胞發生惡性轉化的原因之一。同時，作者還發現Beclin-1蛋白高表達組預后優于低表達組，提示Beclin-1可作為腦膠質瘤預后判斷的輔助指標用于臨床。

總之，作者認為，檢測腦膠質瘤組織中Beclin-1的表達可能對腦膠質瘤惡性程度及預后的判斷有一定的指導意義。

[1]Yue Z,Jin S,Yang C,et al.Beclin 1, an autophagy gene essential for early embryonic development, is a haploinsufficient tumor suppressor[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(25):15077

[2]Huang X,Bai HM,Chen L,et al.Reduced expression of LC3B-Ⅱ and Beclin 1 in glioblastoma multiforme indicates a down-regulated autophagic capacity that relates to the progression of astrocytic tumors[J].J Clin Neurosci,2010,17(12):1515

[3]Cao Y,Klionsky DJ.Physiological functions of Atg6/Beclin 1: a unique autophagy-related protein[J].Cell Res,2007,17(10):839

[4]單國用,劉興安,張松,等.食管鱗狀細胞癌組織中自噬基因Beclin 1蛋白的表達[J].鄭州大學學報:醫學版,2010,45(3):366

[5]郭長青,邵經浩,盧瑞利,等.胃癌組織中Beclin 1和PTEN蛋白的表達[J].鄭州大學學報:醫學版,2010,45(3):463

[6]Tang H,Da L,Mao Y,et al.Hepatitis B virus X protein sensitizes cells to starvation-induced autophagy via up-regulation of beclin 1 expression[J].Hepatology,2009,49(1):60

[7]Aita VM,Liang XH,Murty VV,et al.Cloning and genomic organization of beclin 1, a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21[J].Genomics,1999,59(1):59

[8]Niu TK,Cheng Y,Ren X,et al.Interaction of Beclin 1 with survivin regulates sensitivity of human glioma cells to TRAIL-induced apoptosis[J].FEBS Lett,2010,584(16):3519

[9]馬明明,王雪晶,丁雪冰,等.神經節苷脂誘導膠質瘤細胞自噬性死亡[J].腫瘤基礎與臨床,2012,25(4):281

[10]黃新,白紅民,陳亮,等.自噬相關基因Beclin 1在星形細胞瘤中的表達及意義[J].中國微侵襲神經外科雜志,2009,14(12):559

(2013-11-07收稿 責任編輯王 曼)

Expression of Beclin-1 in human glioma tissue and its relationship with the prognosis

WANGFengwei，NIUGuangming，ZHANGPengyuan，TAOShengzhong

DepartmentofNeurosurgery，theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

glioma；Beclin-1；prognosis

Aim: To explore the relationship between the prognosis and the expression of autophagy-related gene Beclin-1 in human glioma tissue. Methods: Immunohistochemistry and RT-PCR technology were used to detect the expressions of Beclin-1 protein and mRNA in 43 cases of glioma tissue(including 5 cases of grade Ⅰ,17 cases of grade Ⅱ,12 cases of grade Ⅲ and 9 cases of grade Ⅳ)and 11 cases of non-tumor brain tissue. The follow-up data were analyzed by Kaplan-Meier survival analysis. Results: There were significant differences in the expressions of Beclin-1 protein and mRNA among non-tumor brain tissue, grade Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ glioma tissue(F=99.962 and 41.951，P<0.001).The expressions of Beclin-1 protein and mRNA in grade Ⅲ and grade Ⅳ glioma tissue were lower than those in grade Ⅰ,grade Ⅱglioma tissue and non-tumor brain tissue(P<0.05). The expression of Beclin-1 protein in grade Ⅰ and grade Ⅱglioma tissue was lower than that in non-tumor brain tissue(P<0.05).A total of 35 out of the 43 cases were followed up, 16 cases with low expression of Beclin-1 protein and 19 with high expression based on the median expression level.The Kaplan-Meier survival curves of the 2 groups differed from each other(χ2=4.962，P=0.026), and the prognosis of high expression of Beclin-1 protein group was better than that of the low expression group. Conclusion: Beclin-1 may be a new indicator to predict the prognosis of human glioma.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.008

*河南省衛生科技創新型人才工程資助項目 201004126

R739.41