補血養肝法對血虛證小鼠肝細胞凋亡的影響

王正引 ，張小如 ，郭明章 ，全世建

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122； 2.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州510006；

3.福建中醫藥大學中醫學院，福建福州350122）

近年來已有研究報道，補益類方藥如枸杞［1］、右歸飲［2］對細胞凋亡有一定抑制作用，表明補益類方藥的作用機理可能與其干預細胞凋亡有關。中醫藏象理論認為肝藏血，《素問·五臟生成》曰“故人臥血歸于肝，肝受血而能視?！备慰少A藏血液，調節血量，以濡養臟腑，維持機體功能的正常發揮。肝藏血不足是造成血虛證的主要原因之一。本研究基于肝藏血的理論，通過觀察補血養肝法對血虛證小鼠肝細胞凋亡的影響，希冀進一步探討補血養肝法作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6J小鼠，清潔級，30只，雌雄各半，體重（20±2）g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供［動物許可證號：SCK（滬）2012-0002］。

1.1.2 藥物及制備 補血養肝法的代表方選用四物湯，按《方劑學》［3］規定的劑量稱取，熟地 15 g，當歸9 g，白芍9 g，川芎6 g，按傳統方法水煎，煎煮2次，取2次水煎液合并后濃縮成含生藥量約l g/mL，置4℃保存備用。實驗時稀釋成25%。

1.1.3 試劑與儀器 注射用環磷酰胺（通化茂祥制藥有限公司，批號120801），TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（瑞士Roche公司），全自動血液分析儀（日本Sysmex公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 30只C57BL/6J小鼠隨機分為空白組、模型組、實驗組3組，每組10只。

1.2.2 造模 小鼠常規飼養數天適應環境后，參照化學損傷法［4］造模，模型組、實驗組于實驗第1天按小鼠體重0.1 g/kg腹腔注射環磷酰胺1次，空白組予等體積生理鹽水腹腔注射。

1.2.3 給藥實驗組予四物湯5 g/（kg·d）灌胃，1次/d，連續灌胃7 d?？瞻捉M和模型組則給予等體積生理鹽水。

1.2.4 外周血象檢測 在實驗第7天，給藥1 h后，每只小鼠眼眶后靜脈叢取血，檢測外周血紅細胞數、白細胞數、血小板數及血紅蛋白含量。

1.2.5 標本采集及指標檢測 在實驗第8天，頸椎脫臼處死，剖腹取肝臟，4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，肝右前葉切取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm組織塊，以10%甲醛固定，石蠟包埋，連續切片，以備用于原位末端標記（TUNEL）法檢測細胞凋亡。按TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書操作，用蛋白酶K室溫孵育30 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次，滴加50 μL的TUNEL反應混合溶液，在濕盒中37℃孵育60 min。PBS沖洗3次，加入50 μL轉化劑辣根過氧化物酶（POD），在濕盒中37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，加入100 μL二氨基聯苯胺（DAB）底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次。蘇木素復染，封片。每張TUNEL切片選取5個陽性細胞數最多的高倍鏡視野（×400），每個視野計算100個肝細胞，選取其中的陽性細胞，計算陽性細胞數與總細胞數的百分比，即凋亡百分率。在光鏡下分析結果。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠外周血象比較

結果見表1。

表1 各組小鼠外周血象比較 （±s）

表1 各組小鼠外周血象比較 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05

組別 n 紅細胞（1012/L）白細胞（109/L）血小板（109/L）血紅蛋白（g/L）空白組 109.84±0.691） 6.44±1.591） 1039.30±229.93149.90±10.401）模型組 107.51±0.734.67±1.251127.40±218.62120.30±10.06實驗組 108.71±0.681） 6.28±1.991） 1238.80±298.23134.20±7.361）

由表1可見，與模型組相比，實驗組外周血紅細胞計數、白細胞計數以及血紅蛋白含量均升高（P＜0.05），血小板計數各組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 肝細胞凋亡

經TUNEL試劑盒染色，細胞核呈現出棕黃色或棕褐色染色的細胞為陽性細胞，細胞核藍染的細胞是蘇木素復染的陰性細胞。

空白組肝細胞凋亡百分率為（17.60±7.15）%，模型組為（30.10±6.74）%，實驗組為（17.80±5.61）%，模型組較空白組明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組肝細胞凋亡百分率明顯降低（P＜0.05）。結果見圖1。

空白組

模型組

圖1 肝細胞凋亡圖

3 討論

對于補血方藥的補血作用機理的研究，近年來多數集中從免疫功能、骨髓造血功能等方面來探討。譚允育等［5］研究表明，四物湯可明顯改善60Co照射的血虛證模型小鼠的免疫功能，其中有顯著差異的包含了紅細胞抗體、溶血素、外周血B細胞、遲發型超敏反應、T細胞數。薄華本等［6］研究發現，當歸補血湯可能通過改善基質細胞的狀態、增強骨髓細胞之間的黏附來改善骨髓造血微環境。吳宏忠等［7］研究表明，阿膠有效補血活性成分可升高紅、白細胞，其作用機制可能與保護貧血小鼠造血微環境和造血干、祖細胞，刺激髓外造血器官相關造血細胞因子表達有關。如前所述，補血方藥的作用機制之一，可能是通過增強細胞免疫功能，促進骨髓造血，從而達到補血目的。

細胞凋亡是屬于受基因調控的程序性細胞死亡過程，對于機體器官功能正常發揮，保持自身穩定發揮重要作用。因此對細胞凋亡干預機制的研究，已成為目前藥物研發的熱點。國內已有學者從抑制細胞凋亡角度，探討補益類方藥的作用機理。杜江等［8］研究表明，龜鹿二仙膠可抑制模型大鼠軟骨細胞Bax的表達和促進Bcl-2的表達，抑制去勢骨關節炎大鼠關節軟骨細胞凋亡。趙志明等［9］研究發現，何首烏飲可增加大鼠卵巢顆粒細胞內凋亡抑制蛋白Bcl-2表達，減少凋亡促進蛋白Bax表達，而發揮凋亡抑制作用。鄭鴻燕等［10］研究表明，當歸補血湯對感音神經性聾大鼠耳蝸干細胞移植后細胞凋亡有抑制作用。

四物湯是由《金匱要略》膠艾湯化裁而來。方中君藥熟地甘溫味厚，入肝、腎經，長于補血滋陰，填精益髓；臣藥當歸甘辛溫，歸肝、心、脾經，補血活血；佐以白芍酸甘微寒，入肝、脾經，養血柔肝；川芎辛溫入肝、膽、心包經，活血行氣。全方四味藥均入肝經，可補血養肝，用于治療血虛證。因此本研究選用四物湯作為補血養肝法的代表方，從細胞凋亡的角度，探討該法補血作用機理。

本研究結果表明，補血養肝法可改善血虛證小鼠的外周血象，降低肝細胞凋亡百分率，提示補血養肝法作用機理可能與其減少肝細胞凋亡有關，但對于肝細胞凋亡的干預機制還有待進一步研究。

［1］汪君民.枸杞對運動大鼠腎臟 Bcl-2、Bax表達和運動性蛋白尿的影響［J］.西安體育學院學報，2009，26（6）：719-724，730.

［2］陳瑜，沈自尹，陳偉華.補腎及健脾復方對皮質酮大鼠T細胞凋亡信號相關基因群調控模式的對比研究［J］.中西醫結合學報，2004，2（5）：346-349.

［3］李冀.方劑學［M］.3版.北京：中國中醫藥出版社，2012：129.

［4］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.2版.北京：人民衛生出版社，2006：1169.

［5］譚允育，黃守雄，欒永紅，等.四物湯對60Co照射小鼠免疫功能影響的實驗研究［J］.中國實驗臨床免疫學雜志，1994，6（2）：40-43.

［6］薄華本，陳啟助，沈晗，等.當歸補血湯調控骨髓造血機理及對造血微環境的影響［J］.中國新藥與臨床雜志，2013，32（10）：824-828.

［7］吳宏忠，楊帆，崔書亞，等.阿膠酶解成分對貧血小鼠造血系統的保護機制［J］.華東理工大學學報：自然科學版，2008，34（1）：47-52.

［8］杜江，黃遠鵬，李奕修，等.龜鹿二仙膠及其拆方對去勢骨關節炎大鼠關節軟骨中Bax和Bcl-2的影響［J］.中國中醫骨傷科雜志，2013，21（3）：4-7.

［9］趙志明，杜元杰，左一鵬，等.中藥何首烏飲對大鼠卵巢顆粒細胞凋亡相關蛋白bcl-2，bax表達的影響［J］.現代中西醫結合雜志，2012，21（23）：2530-2532，2564.

［10］鄭鴻燕，邰浩清，曾水林.當歸補血湯對感音神經性聾大鼠耳蝸干細胞移植后細胞凋亡的影響［J］.聽力學及言語疾病雜志，2010，18（3）：271-274.