紫外分光光度法測定發酵液中胞二磷膽堿鈉含量

陳天來，彭奇均

(江南大學化學與材料工程學院，江蘇無錫 214122)

胞二磷膽堿鈉(CDPC)是卵磷脂生物合成的重要前體，對于改善腦組織代謝，促進大腦功能恢復和促進蘇醒有較好的療效，其在臨床上常用于急性顱腦外傷和腦手術后的意識障礙［1］。

目前，主要采用生物發酵法合成胞二磷膽堿鈉［2］。生物發酵合成胞二磷膽堿鈉時，在對發酵液進行滅活和固液分離后，發酵液中除胞二磷膽堿鈉外還常含有蛋白質等物質，常采用離子交換樹脂吸附分離其中的雜質以純化胞二磷膽堿鈉［2-5］。

胞二磷膽堿鈉的主要檢測方法有:HPLC法［6-7］、紫外分光光度法［8-10］。HPLC 法操作復雜，分析條件較為苛刻，不利于發酵、分離過程中胞二磷膽堿鈉的快速檢測;紫外分光光度法具有快速、簡便、易于操作等優點。

紫外分光光度法需將胞二磷膽堿鈉配制成含0.1 mol/L鹽酸的溶液，在280 nm的波長下測定其吸光度，而采用離子交換樹脂分離純化胞二磷膽堿鈉的過程中伴隨著溶液pH的變化，在不能確定溶液pH的情況下傳統的紫外分光光度法不適用于胞二磷膽堿鈉分離純化過程中的分析。

雖然傳統的紫外分光光度法并不適用于分離純化過程中胞二磷膽堿鈉的分析，但可通過改進使其能分析任意pH溶液中的胞二磷膽堿鈉含量。本文基于紫外分光光度法，以有別于傳統紫外分光光度法在280 nm下分析，選擇不受溶液 pH影響的265 nm波長為檢測波長作為改進方向，同時研究了不同操作溫度、蛋白質濃度等因素對該方法的影響。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

胞二磷膽堿鈉標準品、胞二磷膽堿鈉發酵液均由蘇州天馬醫藥集團提供;鹽酸、氫氧化鈉均為分析純;牛白蛋白，生物試劑。

TU1901雙光束紫外可見分光光度計(帶恒溫水浴裝置);pH S-25型pH計;EL204電子分析天平。

1.2 溶液配制

1.2.1 不同pH的胞二磷膽堿鈉溶液 以鹽酸及氫氧化鈉為溶質，配制 pH 值分別為 0，2，4，10，12，14的溶液。精密稱取胞二磷膽堿鈉標準品500 mg于燒杯中，加入去離子水溶解并定容于100 mL容量瓶中。

分別準確移取胞二磷膽堿鈉溶液6，10，16，20，24，30 mL于100 mL容量瓶中，分別加入10 mL不同pH溶液，定容至刻度線。最終使濃度分別為30，50，80，100，120，150 μg/mL 的不同濃度的胞二磷膽堿鈉溶液均有 pH 分別為 2，4，6，8，10，12 的胞二磷膽堿鈉溶液。

1.2.2 含不同濃度牛白蛋白的胞二磷膽堿鈉溶液(含胞二磷膽堿鈉2.5 mg/mL) 精密稱取2.500 g的胞二磷膽堿鈉分別以濃度為 50，75，100，125，150μg/mL的牛白蛋白溶液溶解并定容于100 mL容量瓶。

1.2.3 胞二磷膽堿鈉標準液(0.5 mg/mL) 精密稱取胞二磷膽堿鈉標準品50 mg，加入去離子水溶解后定量轉移至100 mL容量瓶中定容，得胞二磷膽堿鈉標準液。

1.3 標準曲線的繪制

分別精密量取 1，2，4，6，8，10，12，16，20，30 mL的胞二磷膽堿鈉標準液至100 mL容量瓶中，并用去離子水定容，測定其在265 nm波長下的吸光度。以胞二磷膽堿鈉濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，見圖1。

圖1 胞二磷膽堿鈉濃度與吸光度的關系Fig.1 Absorbance curve of CDPC in different pH

由圖1可知，胞二磷膽堿鈉溶液在0～150μg/mL的濃度范圍內線性良好，擬合直線方程為 A=0.014 3C+0.001 9，線性相關系數 R2=0.999 7。

2 結果與討論

2.1 溶液p H對胞二磷膽堿鈉吸光度的影響

以去離子水為參比，不同pH的胞二磷膽堿鈉溶液在210～360 nm掃描結果見圖2。

圖2 不同濃度胞二磷膽堿鈉溶液在不同pH下的光譜掃描曲線Fig.2 Absorbance curve of CDPC in different pH

由圖2可知:①胞二磷膽堿鈉濃度30～150 g/mL范圍內，隨pH增大，胞二磷膽堿鈉溶液的最大吸收波長減小;當pH＞6時，胞二磷膽堿鈉吸光度光譜掃描曲線在210～360 nm的范圍內基本重合，pH對胞二磷膽堿鈉吸光度的測量無影響;②在30～150 g/mL的濃度范圍內，相同濃度下，不同pH的胞二磷膽堿鈉溶液的光譜掃描曲線均相交于同一點，即在265 nm波長處不同pH的胞二磷膽堿鈉溶液吸光度均相同，即265 nm下胞二磷膽堿鈉吸光度與pH大小無關，故選擇265 nm作為胞二磷膽堿鈉的檢測波長。

2.2 蛋白質的干擾

將含不同濃度牛白蛋白的胞二磷膽堿鈉溶液稀釋100倍后，以去離子水為參比液，測定其在265 nm波長下的吸光度。結果胞二磷膽堿鈉及蛋白質在紫外光區的吸收區間幾乎重疊，即在265 nm的波長下蛋白質可能會對胞二磷膽堿鈉分析測定產生干擾。

經分析，胞二磷膽堿鈉發酵液中蛋白質含量約為94μg/mL，故配制蛋白質濃度分別為 0～150μg/mL且含25 mg/mL胞二磷膽堿鈉混合溶液，測定其265 nm波長下的吸光度，結果見圖3。

圖3 蛋白質濃度對胞二磷膽堿鈉含量分析的影響Fig.3 Absorbance curve of CDPC in different pH

由圖3可知，在265 nm波長測定得到吸光度的波動＜1.5%，表明蛋白質對該方法分析胞二磷膽堿鈉濃度影響小，可忽略不計。

2.3 測定溫度的影響

分別精密量取 2，4，8，12，16，20 mL 的胞二磷膽堿鈉標準液至100 mL容量瓶中，并用去離子水定容，分別在10，15，20，25，30 ℃的恒溫條件下測定其在265 nm波長下的吸光度，結果見圖4。

圖4 胞二磷膽堿鈉溶液吸光度與溫度的關系Fig.4 Absorbance curve of CDPC in different pH

由圖4可知，在10～30℃的范圍內胞二磷膽堿鈉溶液在265 nm下的吸光度呈現水平，說明吸光度不受溫度的影響，故可在10～30℃的范圍內的任意溫度下測定胞二磷膽堿鈉濃度。

2.4 方法的精密度及加標回收率

2.4.1 精密度 重復測定同一樣品在265 nm的吸光度，結果見表1。

表1 精密度實驗結果Table1 Precision experimental result

由表1可知，方法的相對標準偏差為0.178%，表明方法精密度較高。

2.4.2 加標回收率 吸取10 mL濃度為30μg/mL的胞二磷膽堿鈉溶液8份，分別加入10 mL濃度為40，50μg/mL的胞二磷膽堿鈉溶液混合均勻，測定其吸光度，結果見表2。

表2 加標回收率Table2 Recovery of standard addition

由表2可知，各樣品的加標回收率均＞95%，說明該方法具有較高的準確度。

3 結論

以265 nm作為檢測波長，建立了胞二磷膽堿鈉的紫外吸收分析法，此波長下胞二磷膽堿鈉吸光度不受溶液pH影響。由于發酵液中蛋白質含量小，對胞二磷膽堿鈉分析影響可忽略，并且此方法在10～30℃的范圍內不影響胞二磷膽堿鈉分析。

胞二磷膽堿鈉濃度在一定范圍內與吸光度呈線性相關，其線性回歸方程為A=0.014 3C+0.001 9，線性相關系數 R2=0.999 7，線性范圍為 5～100μg/mL，相對標準偏差為0.178%，平均加標回收率為100.87%，重現性好。本法測定操作簡便、準確，適用于發酵液中胞二磷膽堿鈉含量的測定。

［1］ 顧復昌，楊亮懿.胞二磷膽堿的生產［J］.發酵科技通訊，2007，36(1):9-11.

［2］ 侯立向，趙晜.胞二磷膽堿的發酵合成及其純化［J］.生物化學與生物物理進展，1979(5):40-48.

［3］ 黃穎，邱蔚然，孫翠萍，等.發酵液中提取胞苷二磷酸膽堿的工藝改進［J］.醫藥工業，1985，16(1):3-5.

［4］ 蘇州天馬醫藥集團.胞磷膽堿鈉的制備方法:CN，194461A［P］.2007-04-11.

［5］ 南通秋之友生物科技有限公司.一種從生物轉化或多酶反應液中分離純化胞二磷膽堿鈉的方法:CN，101096380A［P］.2008-01-02.

［6］ 顧頌青.胞磷膽堿鈉及其注射液的HPLC測定［J］.中國醫藥工業雜志，2002，33(8):397-398.

［7］ 佟愛東，鄧兆勇.高效液相色譜法測定胞磷膽堿鈉及有關物質的含量［J］.中國生化藥物雜志，2001，22(1):31-32.

［8］ 中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準二部:第六冊［M］.北京:中華人民共和國衛生部，1998.

［9］ 張蘭存，杜增輝.胞二磷膽堿鈉紫外吸光系數的測定［J］.中國生化藥物雜志，1994，15(1):30-32.

［10］程宓，徐世清，秦建明，等.用紫外分光光度法分析胞二磷膽堿與川芎嗪的配伍［J］.中國療養醫學，2001(5):26-28.