PCR技術在肺外結核診斷中的應用

丁實 周健 畢紅東

【摘 要】目的：本研究的目的是探討PCR技術聯合常規方法在肺外結核疾病中的診斷效果。材料和方法：所有標本均采集于在臨床上疑似肺外結核的病例。我們利用齊尼氏痰涂片檢查（ZNS），改良羅氏培養法（LJM）和PCR技術對勻漿標本進行檢測。結果：總共有182例疑似為肺外結核的標本節接受了上述三種方法的檢查。其中22例經至少一種方法檢測證實為陽性。PCR技術檢測出肺外結核病例最多，其次是細菌培養。結論：聯合使用現有的檢測技術可以提高實驗室對存在于臨床標本中的結核分枝桿菌的檢出率。而PCR技術必須包含在肺外結核的診斷程序之中。

【關鍵詞】肺外結核；PCR 金標準

【文章編號】1004-7484（2014）06-3508-02

結核病是一項重大的公共健康問題。每年，世界范圍內新增確診病例超過900萬，而登記在冊的死亡病例將近200萬[1]。肺外結核占所有免疫功能不全并罹患結核的病人總數的1/5。在HIV陽性個體中，肺外結核發病率非常高，占全部結核病例的50%[2]。由于此病對于標準的抗結核菌療法比較敏感，所以早期精確的診斷至關重要。分子生物學方法是診斷肺外結核較好的一個選擇，PCR技術具有較高的敏感性，特異性和診斷速度[3]。

1 材料和方法：

收集承德醫學院附屬醫院2008年至2013年對193例疑似肺外結核的臨床標本的檢測結果。193例標本均進行PCR檢測，其中11標本由于量比較小，而未進行常規方法檢測。對剩余182例標本進行PCR檢測和常規方法檢測的對照分析。

首先將這些收集的標本進行勻漿化處理。然后對勻漿化的標本進行齊尼氏痰涂片，改良羅氏法培養和PCR技術檢測。使用QIAampDNA微型試劑盒對DNA進行提取。

我們利用兩種PCR體外診斷試劑盒【Real-TM（Sacace）J檢測試劑盒以IS6110為靶序列設計引物，Seeplex多重分子檢測診斷試劑盒（Seegene）以IS6110和MPB64為靶序列設計引物】對標本進行檢測。所有接受PCR檢測的標本均進行齊尼氏痰涂片檢查以及改良羅氏法的細菌培養。我們對培養物進行了為8周的觀察。

統計學分析：我們利用Kappa檢驗確定本研究中不同的檢測方法的結果是否一致。利用卡方檢驗對于數據進行分析。統計學軟件為SPSS20。

2 結果：在所有被檢測的標本中肺外結核總陽性率為12.1%（表一）。其中PCR檢測陽性為20例。結核菌培養陽性為9例，痰涂片法為6例。其中，經三種方法檢測，僅PCR技術顯示為陽性的標本為10例。而PCR檢測為陰性，而常規方法檢測為陽性的標本為2例。僅3例標本，三種檢測方法結果均顯示為陽性。PCR檢測的陽性率在膿液標本中最高（表二）。

由于細菌培養在診斷結核并不是一項理想的金標準，我們應用Kappa檢驗來評價細菌培養和PCR技術檢測結果的一致性水平。結果顯示，兩種方法的檢測結果具有中等水平的一致性，Kappa值為0.59。

和痰涂片這種常規快速的檢測方法相比，由PCR技術檢測出來肺外結核陽性例數明顯增多，具有統計學差異。同樣，PCR檢測出來的陽性病例也明顯多于細菌培養的結果。PCR技術和兩種方法聯合檢測的結果進行對照也具有統計學意義。

3 討論：

在本研究中，182例疑似為肺外結核的病例標本，經不同的方法檢測最終有22例得到確診。本研究中， 細菌培養檢測出的陽性率為3.3%。雖然細菌培養是診斷結核病的金標準，但是其缺乏敏感性、特異性和速度，尤其是在肺外結核的檢測方面。

PCR診斷技術的特異性非常高，而關于敏感性的報道卻并不一樣。我們認為，只要運用合理，PCR技術在診斷肺外結核疾病方面具有非常高的敏感性[8]。本研究中，PCR技術在全部受檢標本中檢測出結核分枝桿菌的比例為11%。相關報道PCR技術在非呼吸系統標本檢出結核桿菌的陽性率為8.6%-63%[9-11]。在本研究，經實驗室診斷證實的病例中，由PCR技術檢出的占90.9%，比例最高。而常規方法檢測總共占到全部病例的54.6%。所有LJM檢測為陽性的病例，也由PCR技術證實為陽性。

本研究顯示，PCR技術是一項非常有效迅速的檢測方法。將PCR技術和培養的檢測結果進行對照分析，二者具有顯著的統計學差異。而單獨應用PCR技術和聯合兩種常規方法檢測的結果之間對照發現，同樣具有顯著的統計學差異。在在我們的研究中，結核桿菌培養和PCR檢測技術存在中等水平的一致性（k=0.59）。PCR技術和結核桿菌培養的結果并非完全一致?？赡苁怯捎赑CR技術比常規方法的檢測診斷效果更好。本研究顯示，和其他診斷技術相比，PCR是診斷肺外結核最好的方法。

PCR技術對兩例標本檢測結果為陰性，而通過常規方法檢測為陽性。我們排除了標本中存在PCR抑制劑的可能性，而其陰性的結果可能是由于IS6110插入序列片段復制物含量比較低的原因。目前為止，PCR技術的敏感性和結核病的診斷方面的相關理論還處于探索之中。WHO和其他健康機構現今仍然推薦結核菌培養作為診斷的金標準。

PCR技術在許多情況下已經成為了一項常規診療程序。因為其對標本的結核分支桿菌檢測結果非?？煽?。并且，比結核菌培養要快一到數個星期。PCR技術的敏感性和特異性和結核桿菌培養方法相當，但是這種敏感性是建立在液體培養體系之上的。利用固體培養和PCR技術進行對照是不合適的。

雖然我們總共檢測了193例標本，但是只是對其中182例進行了PCR檢測和常規方法檢測之間的對比研究。剩下的11例由于標本量太小不能用常規方法檢測。其中兩例標本PCR檢測的結果為陽性。PCR技術對于最低量為200μl標本均可以進行檢測。

由于實驗室診斷肺外結核存在困難以及沒有可供利用的金標準，因此聯合應用現有幾種檢測技術用于診斷結核疾病是一個比較理想的策略，這樣可以使實驗室為臨床工作者提供更多的信息進行參考。

參考文獻

[1] Rylancea J， Pai M， Lienhardtd C， Garner P. Priorities for tuberculosis research： a systematic review. Lancet Infect Dis. 2010；10：889-92.

[2] Sharma SK， Mohan A. Extrapulmonary tuberculosis. Indian J Med Res. 2004； 120： 316-53.

[3] Katoch VM. Newer Diagnostic Techniques for Tuberculosis. Ind J Med Res . 2004；120：418-28

[4] Hillemann D， Rusch-Gerdes S， Boehme C， Richter E. Rapid Molecular Detection of Extrapulmonary Tuberculosis by the Automated GeneXpert MTB/RIF System. J Clin Microbiol. 2011；49：1202-05.

[5 Portillo-Gómez L， Morris SL， Panduro A. Rapid and efficient detection of extra-pulmonary Mycobacterium tuberculosis by PCR analysis. Int J Tuberc Lung Dis . 2000；4：361-70.

[6] Amin I， Idrees M， Awan Z， Shahid M， Afzal S， Hussain A. PCR could be a method of choice for identification of both pulmonary and extra-pulmonary tuberculosis. BMC Research Notes. 2011；4：332.