清咽喉合劑微生物限度檢查方法的驗證

余曉霞 馬永良 劉春霞

清咽喉合劑為中山大學孫逸仙紀念醫院的特色中藥制劑, 其主要由崗梅根、野菊花、蒲公英三種中藥材煎煮濃縮制成［1］, 具有清熱、消炎、解毒作用?，F根據《中國藥典》2010年版(一部)［2］, 對清咽喉合劑微生物限度檢查方法進行驗證, 以保證測定結果的可靠性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)、303A-1生化培養箱(上海浦東榮豐科學儀器有限公司)、SPX-100B生化培養箱(上海悅豐儀器儀表有限公司)。

1.2 試藥 營養瓊脂培養基(批號：140308), 玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號：140228), 營養肉湯培養基(批號：130521), 改良馬丁培養基(批號：1401222), 改良馬丁瓊脂培養基(批號：130910), 膽鹽乳糖培養基(批號：1402132), MUG培養基(批號：135012), 曙紅亞甲藍瓊脂培養基(批號：1310312)(以上均來源于北京三藥科技開發公司)。清咽喉合劑(規格：100 ml,批號：201312248, 201312258, 201312308, 中山大學孫逸仙紀念醫院)。

1.3 菌種 大腸埃希菌(escherichia coli)［ CMCC(B)44 102］,金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］, 枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)［ CMCC(B)63 501］, 白色念珠菌(candida albicans)［ CMCC(F)98 001］, 黑 曲 霉(aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］(以上菌種的凍干菌均購自中國食品藥品生物檢定研究院)。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌至營養肉湯培養基, 經35 ℃培養24 h, 取其培養物, 用0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍稀釋至約50～100 cfu/ml的菌懸液備用。接種白色念珠菌至改良馬丁培養基, 經25℃培養24～48 h, 取其培養物, 用0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍稀釋至約50～100 cfu/ml的菌懸液備用。取2～8℃保藏的黑曲霉孢子混懸液, 稀釋至約50～100 cfu/ml的孢子懸液備用。

2.2 供試液制備 取供試品原液, 混勻, 作為供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證

2.3.1 試驗組 分別取供試液、試驗菌液各1 ml, 注入同一平皿中, 立即傾注相應的不超過45℃的瓊脂培養基, 待凝結后, 按規定培養, 點計平均菌落數。每株試驗菌平行制備2個平皿。

2.3.2 菌液組 取試驗菌液1 ml, 注入平皿中, 同“2.3.1”項下方法操作。

2.3.3 供試品對照組 取供試液1 ml, 注入平皿中, 也同“2.3.1”項下方法操作。

表1 計數驗證各菌株回收率結果(%)

由表1可見, 用1 ml/皿供試液時, 各菌株的回收率均可達到70%以上, 且3次均能重現試驗結果, 因此本品的細菌、霉菌及酵母菌計數可用平皿法檢查(即1 ml/皿)。

2.4 控制菌檢查方法的驗證 本品為口服給藥制劑, 控制菌應檢查大腸埃希菌。大腸埃希菌檢查法的驗證：分別取供試液1 ml加至膽鹽乳糖培養基100 ml中, 加入10～100 cfu大腸埃希菌, 按《中國藥典》2010年版(二部)大腸埃希菌檢查法進行驗證。結果見表2。

表2 控制菌驗證結果

由表2可見, 本品可用常規法檢查大腸埃希菌。

3 討論

研究表明［3,4］, 崗梅根和野菊花兩種藥材均對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等有較強的抑制作用。清咽喉合劑由以上兩種藥材煎煮而成。實驗結果表明, 采用常規法檢查清咽喉合劑的細菌、霉菌、酵母菌數, 回收率均>75%, 控制菌大腸埃希菌可檢出, 該法可為清咽喉合劑微生物限度檢查的標準。

［1］伍俊妍, 李國成, 林曉珊, 等.清咽喉合劑質量標準的研究.中藥材, 2008, 31(9):1431-1433.

［2］國家藥典委員會.中國藥典(一部).北京:中國醫藥科技出版社, 2010：附錄XIII C.

［3］何少璋, 張一萍, 喻麗元.崗梅對微生物的作用研究.現代醫院,2008(5):12-13.

［4］方靜, 王德, 周學琴.野菊花兩種提取方式對5種常見細菌的抑菌效果的比較.數理醫藥學雜志, 2007, 20(3):368-369.