脂肪細胞去分化過程中脂滴丟失的調控機制研究進展

脂肪細胞去分化過程中脂滴丟失的調控機制研究進展*

李翼飛 綜述王兆杰 審校

(遵義醫學院第五附屬(珠海)醫院骨科， 廣東 珠海 519100)

【摘要】低氧低血環境是去分化過程的起始條件也是脂肪細胞發生形態顯著改變的重要誘導因素。利用天花板培養法培養脂肪細胞，使其去分化成為前體脂肪細胞，此過程中最顯著的形態變化是存在于脂肪細胞胞質中并占據脂肪細胞體積90%的脂滴的丟失，細胞由單房圓形變化為成纖維樣細胞，并獲得了多向分化潛能。本文基于去分化脂肪細胞(DA)的無血清培養，從低氧、低血等誘導因素方面綜述脂肪細胞去分化的調控機制，為之后進一步研究去分化調控機制提供新的理論，并對脂肪細胞去分化的天花板培養提供簡便可行的培養模式。本文查閱近10年有關低血低氧對脂肪細胞去分化影響的文獻，并對脂肪細胞去分化過程中脂滴丟失的調控機制研究進展進行綜述。

【關鍵詞】去分化脂肪細胞; 脂肪組織 組織工程; 無血清培養

【中圖分類號】R 446.8【文獻標志碼】A

基金項目：貴州省科技廳

收稿日期：( 2014-05-04； 編輯： 張翰林)

Research status of the mechanism of lipid drops lost during the process of adipocyte dedifferentiationLI Jifeireviewing,WANG Zhaojiechecking

(DepartmentofOsteology,TheFifthAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege(Zhuhai),Zhuhai519100,Guangdong)

【Objective】The conditions of hypoxia and free serum medium are the initial induce condition of the process of dedifferentiation, which lead to the change of aipocyte’s phenotype and functional gene.After ceiling culture, adipocyte shift into lipid-free fiberoblast-like cells, and regain mutilineage properties.We retrieved the recent 10 years literatures that correlate to adipocyte culture of hypoxia condition and free serum medium condition.

【Key words】Adipocyte dedifferentiation; Fat tissue tissue engineering; Serum-free medium

通信作者：王兆杰，《西部醫學》編委，E-mail:zhaojiewang@163.com

去分化脂肪細胞(DA)因其來源廣，數量充足，功能良好，穩定性強，純度高，取材方便等特點，近年來備受關注。脂肪組織可以通過特殊信號調控免疫調節，而胞質中的脂滴占成熟脂肪細胞體積的90%，也因其存在表現出特定的細胞形態特點[1]。謂去分化[2]是指在一定信號和刺激因子作用下，已分化成熟的細胞和組織倒退分化，返回原始幼稚狀態，這是一種通過自噬，胞質脫落，陳舊分泌物和殘體外排等作用清除衰老的細胞器和細胞質成分以及細胞有害物質的過程。細胞質凈化，細胞體變小，核仁重新出現，終末期分化細胞變成未分化狀態祖細胞，去分化后的細胞往往可以恢復活力。1975年van等[3]首次發現成熟脂肪細胞在體外培養的過程中發生了形態上的變化，從單房圓形逐漸丟失胞質內的脂滴，呈成纖維細胞樣[4]，在此過程中不僅細胞形態發生了改變，基因表達也發生相應改變，呈脂肪前體細胞的特征[5]。盡管DA近年來成為研究熱點，并且初步應用于臨床，但是去分化的機制、培養條件以等許多問題尚未解決。

1去分化脂肪細胞的培養

1.1天花板培養1986年由sugihara首次提出[10](見于表格1)，不同于脂肪間充質干細胞的下沉性，成熟脂肪細胞具有漂浮性，在裝滿培養液的培養瓶中，漂浮的脂肪細胞會貼住內壁，貼壁細胞會逐漸發生形態上的變化，大脂滴變為多個小脂滴，根據不同的研究顯示[11-15]，經過 2~3周不加干預的培養后，脂滴逐漸消失，細胞形態逐漸變為成纖維樣。

1.2改良天花板培養近年應用較多的是matsumoto提出的改良天花板貼壁法(16)，自脂肪組織中分離脂肪細胞的方法與前者相同，37℃條件下震蕩消化一小時后以135g離心3min后，提取表面漂浮的脂肪細胞，于加入20%胎牛血清的DMEM中培養，7天后去除培養液并倒轉培養瓶繼續培養。并證實不用添加特殊細胞因子和條件進行誘導即可獲得貼壁DA，但培養的同時仍需注意[17]:①由于脂肪組織含有多種細胞如脂肪細胞，脂肪干細胞，脂肪前體細胞，平滑肌細胞，血細胞，內皮細胞，成纖維細胞，外膜細胞等(11,18-21)，稍有不慎，這些細胞將會影響DA的純度。為提高分離脂肪組織的純度，充分的震蕩和Ⅰ型膠原酶充分消化至關重要。此外，位獲得高純度DA，還要求對大體組織重復研磨、過濾、沖洗和離心。②在脂肪細胞開始接觸培養瓶壁的時候盡可能不要干涉和移動是脂肪細胞成功去分化的關鍵。

1.3脂肪細胞的無血清培養國內王歡歡等等[48]利用無血清培養基培養豬成熟脂肪細胞，培養方法在天花板的基礎上，使用了無血清的DMEM培養液，并且棄用低速的135g離心3min，而選用在500、800、1200g三個梯度離心后選取效果最好的800g離心15min漂洗，吸取1ml上清液至新的離心管，加入適量無血清培養液800g離心15min，取上清后，轉移入到25cm3培養瓶中，加滿無血清培養液于37℃，5%CO2條件培養，保證了脂肪細胞的純度和提取效率。10d后成熟脂肪細胞完全去分化成為成纖維樣脂肪前體細胞，行rt-PCR油紅O等檢測，證實成功獲得DA。

2脂質代謝的相關功能基因、功能酶和細胞因子

2.1去分化過程中功能基因的改變在去分化過程中有362種基因下調，308種上調，其中下調的功能基因中幾乎都是針對脂肪酸代謝的基因和脂滴代謝的基因發生了改變，包括ADIPOQ,LIPE,PDK4,LPL,FASN,PPARγ和FABP4，以上功能基因關系著脂滴形態的改變和甘油三酯以及脂肪酸的代謝[23]。而上調基因主要是與細胞形態發生改變、遷移、增殖分化的能力獲得有著重要的決定作用。所以，脂滴的丟失主要與脂肪酸代謝和脂滴代謝的調控基因下調有關。

2.1.1PPARγ氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ)是具有重要生物學功能的轉錄因子，可調控脂肪細胞分泌的多種蛋白質因子基因的表達[24]PPAR基因家族包括α、β和γ三種成員，在機體脂類代謝及脂肪細胞的分化中發揮重要作用，它是脂肪細胞基因表達和胰島素細胞間信號轉導的主要調節者，參與脂肪細胞分化和糖脂代謝的調節[25]，在脂肪細胞的分化過程中不僅能促進前體脂肪細胞的分化，而且也能促進非脂肪細胞轉分化成脂肪細胞，與脂肪細胞生長分化關系密切。

2.1.2c/EBPα c/EBP蛋白因其能與啟動子的CCAAT區及多種病毒增強子結合而得名[26]。Luft等指出[27]C/EBPα對成脂分化作用比PPARγ更大一些，但是c/EBPα對脂質代謝的調控依賴于PPARγ[28]。

2.2乙酰輔酶A羧化酶與脂肪酸合成酶動物體脂沉積[29]所需要的脂肪酸大多來自脂肪酸的從頭合成(De novo fatty acid synthesis)，即由脂肪酸合成酶催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸，進而合成甘油三酯[30,31]。脂肪酸合成初始基礎物質在乙酰CoA合成酶(ACS)的催化下合成乙酰CoA，然后在ACC催化下形成丙二酸單酰CoA，為脂肪酸合成提供原料，繼而在FAS的作用下，催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸[32]。所以當FAS與ACC表達水平的升高時能夠顯著增加甘油三酯在細胞內的沉積[40]。

2.3TNFα、IL6 腫瘤壞死因子多由脂肪組織中存在的脫脂細胞分泌[33]白介素6則由TNFα誘導合成[37]，在脂質代謝的過程中Green等[6-8]發現TNFα下調脂肪表面標志物和相關功能基因的表達，如(9)c/EBPα，RXRα，PPARγ等基因，并通過[34]自分泌和旁分泌途徑發揮刺激脂肪細胞分解，尤其是降低LPL的生成和活性，誘導脂肪細胞分化(破壞前脂肪細胞的分化，誘導成熟脂肪細胞逆分化)，加速脂肪細胞、前脂肪細胞凋亡的作用，以促成脂肪細胞的去分化。有研究表明[35]肥胖病人的脂肪組織可以誘導TNFα和IL6濃度的提升，所以推測脂肪沉積程度和脂肪細胞數量是TNFα和IL6分泌的誘導因素，并且通過抑制脂質合成來阻止脂肪的沉積和脂肪細胞數目的增長。

3去分化過程中脂滴丟失的調控機制

3.1脂肪細胞形態的改變廖云君等研究證實[2]，為了模仿局部低氧低血的內環境，在1%低濃度胎牛血清以及無氧條件下體外培養脂肪細胞10d，缺氧缺血可啟動脂肪細胞脫去脂滴，圓形單房細胞移行成成纖維樣細胞，從而實現去分化。而移植早期缺血缺氧的環境下，部分成熟脂肪細胞去分化，脫去脂滴，變成成纖維細胞樣細胞，使細胞提高了耐受能力，并逃避宿主巨噬細胞的攻擊[22]。證明了低血低氧培養基培養可以達到使脂肪細胞去分化的效果。

3.2脂肪酸的代謝改變國外研究者發現，肥胖患者脂肪組織中存在局部低氧的環境，低氧是誘導脂肪細胞凋亡的誘導因素。Yin等發現[36]，在低氧環境下，脂肪酸的積累減少，脂肪酸轉運蛋白FATP1 和 CD36的表達受到明顯的抑制，脂解作用增強，脂質代謝加速，造成了脂肪細胞胞質中脂滴的大量減少。

3.3功能基因的改變Luther等發現[38]局部低氧環境能誘導低氧誘導因子(HIFs)表達，HIFs能誘導AP-1轉錄相關因子Fra-2的表達上調，并且Fra-2能夠給與PPARγ結合，并抑制PPARγ表達。還有學者研究發現[36]脂肪組織低氧環境(ATH)會加速脂質代謝，并且抑制轉錄因子PPARγ和 C/EBPα的表達，促使胞質中的脂滴合成減少。而金小嵐等發現[39]，在不同低氧環境下誘導基質干細胞成骨分化時，與常氧組相比，各低氧組BMP-2蛋白和RUNX2表達呈不同程度的上調，并且氧濃度越低，表達上調越明顯。RUNX2與PPARγ呈此消彼長的關系，而RUNX2的表達上調，表明PPARγ的表達下調，證明低氧培養能抑制干細胞的成脂分化。

3.4脂肪酶的改變 Semenkovich等[40]指出動物體脂水平和FAS的表達成正相關，而HSL水平與脂解活力呈強線性關系[41]，HSL是甘油三酯水解限速酶，能夠抑制甘油三酯在脂肪細胞中的積累[42]。國內盧建雄的實驗小組研究證明[43]，血清剝奪可以促使脂肪細胞去分化，依血清剝奪時間延長，脂肪細胞激素敏感酯酶mRNA水平顯著增高，而FAS，ACC1水平顯著下降，導致脂肪酸積累顯著減少，脂滴逐漸縮小。無血清條件培養脂肪細胞36小時，細胞脂肪沉積下降22.6%，72h培養脂肪沉積下降50.7%，恢復血清條件培養后脂質沉積于36h，72h分別提高30.8%和65.4%。行rt-PCR后顯示在無血清培養的條件下，FAS與ACC1mRNA水平顯著下調，而恢復血清培養條件后恢復到正常水平。從而證明血清條件的剝奪使得HSL表達上調，FAS，ACC1表達下調，在脂滴丟失中起到了重要的生脂抑制和脂解加速作用，由此可以推斷去分化過程中脂滴丟失與動物血清有密切的關系。

3.5細胞因子表達的改變白介素6(IL-6)和腫瘤破壞因子(TNFα)是由巨噬細胞分泌的炎性介質，可以抑制脂聯素的表達[44]，從而可以抑制脂質代謝。不同實驗小組驗證[44，45]低氧條件可以抑制脂聯素分泌，同時使得TNF-α和IL-6表達上調，并可激活NF-κB[46]通路，增加轉錄抑制子組蛋白去乙酰酶3(HDAC3)向細胞核內以為，來抑制PPARγ的活性[47]，從而使得脂質分解加速。

4小結與展望

去分化脂肪細胞具有來源廣泛、存儲豐富、抗衰老能力強、多向分化能力強、穩定性高、取材方便、同源性高等優點，是優秀的組織工程種子細胞。

在低氧低血的培養條件下，脂肪細胞發生了去分化，脂肪細胞的形態發生了變化，由單房圓形細胞，變成了成纖維樣細胞，并且功能基因(PPARγ，C/EBPα)、脂肪酶(FAS,ACC1)、以及脂質代謝相關的細胞因子(TNFα、IL6)的表達都發生了相應的改變，使得脂質代謝增強，脂肪酸積累減少，甘油三酯合成減少，從而使脂質合成抑制，造成脂肪細胞胞質中的脂滴減少丟失。由此可認為低氧無血清的培養條件是啟動脂肪細胞去分化的誘導因素之一。

目前的試驗，細胞培養基中多加入了動物血清，但是血清中的成分復雜，并且有可能會引發動物疾病的感染和不必要的免疫應答反應，對試驗的結果有可能產生干擾，對臨床試驗造成了相應的障礙，使得試驗難以應用于臨床研究。加入血清的培養基增加試驗了的成本，并且是細菌的良好環境，容易造成培養基的污染。

骨折初期局部低氧低血的情況適合去分化脂肪細胞的生存環境，并有效抑制成脂分化趨勢(去分化脂肪細胞具有耐低氧耐低血的環境)，可以為骨住址工程提供良好的種子細胞，而且無血清條件培養脂肪細胞可有效促進脂肪細胞去分化的過程，可以在天花板培養中考慮不加入血清，從而保證了實驗效率和節省資源。目前國內無血清培養與加入胎牛血清培養基的去分化脂肪細胞多向分化能力比較試驗實例甚少。其他調節途徑對于脂肪細胞去分化的調控機制還未清楚，例如wnt信號通路調節的改變對于脂肪細胞去分化過程的影響，以及其他功能基因表達的改變在脂肪細胞去分化過程中發揮的作用等，這些問題有待于未來的試驗提供明確的結果。

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回歸分析中應正確使用r、R、R2三種符號

回歸分析中所獲取的r是相關系數，R是復相關系數(Frisch R, 1934)，R2是決定系數或相關指數。r是簡單相關系數，描述兩變量間相關關系，或直線回歸中反應變量與自變量之間的相關關系。在多元線性回歸(多重線性回歸)分析中，R是復相關系數，回歸平方和與總回歸平方和之比的平方根，描述反應變量與多個自變量之間的線性相關關系。在多元線性回歸(多重線性回歸)分析中，R2是R的平方，稱決定系數或相關指數，是回歸平方和在整個反應變量平方和(總回歸平方和)中所占比重，一般R2愈大表示回歸模型擬合愈好；但R2過大，意味著可能存在多重共線性問題，常用容忍度(1-R2)、方差膨脹因子(VIF= 1/(1-R2))等指標判斷，當容忍度小于0.1，或VIF>10提示存在多重共線性問題。

(四川大學華西公共衛生學院陳彬)