大容量雙肺灌洗對煤塵肺患者免疫細胞和細胞因子的影響

張洪亮++范華東++陸華東

[摘要] 目的 分析大容量雙肺灌洗（Massive whole-lung lavage，MWLL）對煤塵肺患者免疫細胞及細胞因子的影響，為煤塵肺患者的治療提供依據。 方法 對70例煤塵肺患者實施MWLL治療，共灌洗10～15次，治療前、治療后采用酶聯免疫吸附法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、Clara細胞分泌蛋白-10（CC-10）、轉化因子-β1（TGF-β1），采用流式細胞儀檢測外周血T細胞亞群。 結果 治療后Ⅰ期、Ⅱ期患者CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、TNF-α、TGF-β1、CC-10與治療前比較，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；Ⅲ期患者治療后CD4+、CD4+/CD8+比值、TNF-α、TGF-β1與治療前比較，差異有統計學意義（P<0.05），但治療前、后CD8+、CC-10比較，差異無統計學意義（P>0.05）。 結論 MWLL治療在短期內能改善煤塵肺患者的體液免疫及細胞免疫。

[關鍵詞] 煤塵肺；大容量雙肺灌洗；T細胞亞群；細胞因子

[中圖分類號] R472 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2015）01-0013-03

Massive whole-lung lavage impact on immune cells and cytokines in patients with pneumoconiosis

ZHANG Hongliang1 FAN Huadong1 LU Huadong2

1.Changguang Group Iimited Iiability Company Worker's Hospital，Huzhou 313117， China；2.Respiratory Department， Huzhou City Centre Hospital in Zhejiang Province，Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To analyze MWLL impact on immune cells and cytokines in patients with pneumoconiosis，and to provide the basis for coal pneumoconiosis patients. Methods 70 cases of pneumoconiosis implement MWLL treatment of lavage 10 to 15 times，by enzyme-linked immunosorbent assay of serum tumor necrosis factor-α（TNF-α），Clara cell secretory protein 10（CC-10），transforming growth factor-β1（TGF-β1），the use of flow cytometry in peripheral blood T cell subsets before and after treatment. Results CD4+，CD8+，CD4+/CD8+ratio，TNF-α，TGF-β1，CC-10 of periodⅠ，Ⅱpatients，the difference was statistically significant after treatment compared with before treatment （P<0.05 or P<0.01）； CD4+，CD4+/CD8+ratio，TNF-α，TGF-β1 of period Ⅲ patients，the difference was statistically significant after treatment compared with before treatment（P<0.05，but the difference of CD8+，CC-10 was not statistically significant（P>0.05）. Conclusion MWLL treatment can improve coal pneumoconiosis humoral and cellular immunity in the short term.

[Key words] Coal pneumoconiosis； Lavage lung capacity； T cell subsets； Cytokine

煤塵肺多因患者長期暴露在高粉塵環境中，煤塵堆積在肺內所致[1]。然而，臨床對于煤塵肺的具體發病機制目前尚無定論，可能與煤塵堆積引發的細胞免疫紊亂及炎性反應有關[2]。大容量雙肺灌洗（MWLL）最早是用于治療肺泡蛋白沉著癥，其通過清除沉著的蛋白而改善患者體液免疫及細胞免疫功能，進而達到治療的目的。本文對70例煤塵肺患者實施MWLL治療，分析其對患者T免疫細胞亞群及與煤塵肺相關的細胞因子的變化，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月～2014年1月到長廣醫院就治的煤塵肺患者70例。入選標準：①符合《塵肺病診斷標準》（GBZ70-2009）中相關診斷標準[3]，并經高仟伏X射線胸片檢查確診；②符合MWLL治療指征；③接觸煤塵、巖塵、混合粉塵的混合性或單純塵肺患者。排除標準：①年齡>65歲；②心肺功能低下、凝血功能障礙、伴有嚴重支氣管畸形者；③伴有活動性肺結核者；④近2周有肺部感染、哮喘表現。70例均為男性，其中Ⅰ期28例，年齡35～59歲，平均（51.3±8.2）歲；接觸粉塵年限10～32年，平均（22.1±7.7）年；Ⅱ期32例，年齡32～60歲，平均（50.7±8.1）歲；接觸粉塵年限8～33年，平均（22.5±7.5）年；Ⅲ期10例，年齡30～57歲，平均（51.2±8.3）歲；接觸粉塵年限7～34年，平均（22.6±7.8）年。三組一般資料比較無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 MWLL方法

70例均在靜脈復合麻醉下實施MWLL治療?；颊呷∑脚P位或取灌洗側居上斜臥位（25°～30°），連接Solar多功能監護儀，將雙腔支氣管導管（RoberFshaw 管）插入患者支氣管及氣管，確認雙肺隔離滿意后，一側肺給予純氧通氣，另一側采用細支氣管鏡檢查確定球囊定位良好后開始灌洗，一般先右后左。在灌洗前將灌洗液加溫至37℃，首次灌洗500 mL，觀察患者心電圖、血氧飽和度等無異常則反復灌洗。根據肺容量每次灌入量1000～2000 mL，隨后負壓4～5 kPa吸出等量的肺灌洗液，于第3、6、9次負壓吸出灌洗液末給予加壓純氧通氣，加壓最大壓力<4 kPa，負壓吸出與正壓通氣要交替進行，反復灌洗[4]。一側灌洗結束后，待殘留液基本吸收，患者呼吸基本恢復、肺順應性接近灌洗前水平，生命體征平穩后，以相同方法換另一側灌洗，雙肺共灌洗10～15次，直至灌洗回收液變清亮為止，一般一側灌洗次數<12次。

1.3 檢測方法

治療前2 d及MWLL灌洗結束后2 d分別抽取空腹靜脈血4 mL。取2 mL靜脈血置于EDFA抗凝管中，采用Beckman流式細胞儀（美國生產）檢測F淋巴細胞亞群CD4+、CD8+占細胞總數的比例，并計算兩者的比值。試劑購于美國BD公司，采用CD4+FITC、CD8+PE鼠抗人熒光標記抗體。再取2 mL進行3000 r/min離心處理10 min，取上層血清，置于-20℃冰箱中保存。12 h內采用雙抗酶聯免疫吸附法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、Clara細胞分泌蛋白-10（CC-10）、轉化因子-β1（TGF-β1）。儀器為ELX800酶標儀（美國生產），試劑盒購于深圳晶美生物工程有效公司。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件包對數據進行統計學分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用F檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療前、后免疫細胞變化

Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治療后CD4+、CD4+/CD8+比值高于治療前，Ⅰ期、Ⅱ期患者治療后CD8+低于治療前，差異有統計學意義（P<0.05）；Ⅲ期患者CD8+治療前、后比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 治療前、后細胞因子變化

Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治療后TNF-α高于治療前，TGF-β1顯著低于治療前；Ⅰ期、Ⅱ期患者治療后CC-10高于治療前，差異有統計學意義（P<0.05），但Ⅲ期患者CC-10治療前、后比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

3 討論

我國是煤塵肺的高發地區，據統計我國煤塵肺患者約有100萬人，占全世界的50%以上，而且每年新增600例以上[5]，對患者生活質量及生存帶來巨大威脅。

煤塵沉積引發煤塵肺的機制復雜，但其病因明確。粉塵滯留在毛細支氣管及肺泡上引發炎癥反應及吞塵使巨噬細胞增加是煤塵肺的主要致病因素[6]。Toru等[7]研究發現，在煤塵肺進展過程中，有大量的活性介質及細胞因子參與，同時伴有免疫功能失衡。Rong等[8]研究報道，在煤塵肺進展過程中，各種炎性介質及細胞因子表現出不同的變化，最典型的是TNF-α下降、TGF-β1升高、白細胞介素-6（IL-6）升高。同時T細胞亞群在數量及比例上也有所改變，如CD4+下降，CD8+升高，CD4+/CD8+下降等。本研究中煤塵肺患者治療前均伴有TNF-α下降，FGF-β1升高，CD4+下降， CD8+升高，CD4+/CD8+下降等表現，尤其是Ⅲ期患者上述細胞因子及免疫細胞變化更明顯，與文獻報道基本相符，證實在煤塵肺進展中伴有免疫功能及細胞因子失調。

MWLL最早是用于治療肺泡蛋白沉著癥[9]，由于其能有效清除殘留在肺泡內的粉塵、炎性細胞及巨噬細胞等而在煤塵肺的治療中廣泛適用，但其治療機制目前尚未明確，臨床推測其可能通過改善機體免疫功能及糾正細胞因子紊亂而實現治療目的[10]。煤塵肺患者肺泡內大量沉積的難溶性煤塵對巨噬細胞有毒性作用，導致肺泡內巨噬細胞凋亡，使得TNF-α合成及釋放減少，嚴重影響機體免疫功能。Steffen等[11]研究報道，MWLL可將沉積在肺泡內的沉渣、粉塵清除，機體內環境得到改善，TNF-α的釋放增加。我國學者蔚巖等[12]研究得到相同的結論，機體吸入大量的粉塵后，粉塵直接損傷Clara細胞、巨噬細胞，使得CC-10蛋白、TNF-α的合成及釋放減少，隨著機體粉塵的清除，CC-10、TNF-α的含量逐漸上升。本研究中Ⅰ期、Ⅱ期患者治療后CC-10、TNF-α均有明顯上升，提示MWLL可糾正機體細胞因子紊亂。TGF-β1是肺部纖維化發展的重要調節因子，其通過上調纖維粘連蛋白與膠原蛋白基因的表達而降低蛋白酶的分泌，從而參與塵肺的纖維化進程[13]。本研究中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治療前TGF-β1顯著升高，尤其是Ⅲ期患者的TGF-β1含量是普通人的3倍。張志平等[14]研究認為，煤塵肺患者TGF-β1含量升高的原因是粉塵中含有大量的SiO2，SiO2可激活網狀內皮系統物質，其中包括TGF-β1，進而促進膠原纖維纖維化進程。本研究中，治療后Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者TGF-β1顯著低于治療前（P<0.05），可能與MWLL將沉積在肺內的SiO2清除有關。

國內外研究均證實，煤塵堆積在肺泡內損傷巨噬細胞，一方面可促進炎性細胞的釋放而產生炎癥反應；另一方面可釋放一種強烈的內源性免疫抑制劑前列腺素 E2（PEG2），使T細胞免疫功能癱瘓[15]。本研究中Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治療前CD4+下降，CD8+升高，CD4+/CD8+下降，免疫功能受到一定抑制。MWLL治療后，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治療后CD4+、CD4+/CD8+比值高于治療前，Ⅰ期、Ⅱ期患者治療后CD8+低于治療前（P<0.05），與Ga■Fane等[16]報道基本相符，證實MWLL可改善煤塵肺患者的細胞免疫功能。

值得注意的是，由于晚期煤塵肺（Ⅲ期）患者肺纖維化程度嚴重，臨床認為晚期煤塵肺患者洗肺治療的收效甚微，往往放棄洗肺治療。本研究中，Ⅲ期患者經過MWLL治療后，T細胞亞群、細胞因子的變化雖然沒有Ⅰ期、Ⅱ期患者的明顯，或所需的療程較長，但治療后TNF-α、TGF-β1、CD4+、CD4+/CD8+比值與治療前比較有顯著差異（P<0.05），提示對Ⅲ期煤塵肺患者進行全肺灌洗的重要性。

綜上所述，MWLL治療在短期內能改善煤塵肺患者的體液免疫及細胞免疫。

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（收稿日期：2014-06-05）