基于電子鼻的青蛤(Cyclina sinensis)軟組織多氯聯苯的快速檢測方法研究*

呂 燕 王祖忠 胡玲萍 黃 健 周 君張春丹 李 曄 蘇秀榕①

(1. 寧波大學海洋學院 寧波 315211; 2. 北京普析通用儀器責任有限公司 北京 101200)

多氯聯苯(Polychlorinated biphenyls, PCBs)是聯苯苯環上的氫被氯取代而形成的多氯化合物, 對生物體有積蓄性毒害作用的一類持久性有機污染物的總稱, 被列為斯德哥爾摩公約中優先控制的12類持久性有機污染物之一(穆季平, 2006; 蔣慧等, 2010),具有致畸、致癌和致突變性(Ross, 2004)。多氯聯苯是德國施米特和舒爾茨于1881年首先合成的, 美國于1929年最先開始生產, 20世紀60年代中期, 全世界多氯聯苯的產量達到高峰, 年產約為10萬噸(陳春花,2010)。據估計, 全世界已生產的和使用中的PCB遠超過100萬噸, 其中已有1/4—1/3進入人類環境, 造成危害。雖然多氯聯苯等持久性有機污染物(POPs)已被國際禁止生產和使用, 但是由于當時使用量大, 在環境中具有持久污染性, 至今仍能在環境樣品和食品中檢測到這些有機氯化合物(Chiaet al, 2006; 朱云海等,2012)。作為水產品生產大國, 目前我國海域水產品體內多氯聯苯等的污染物的含量還是比較高的, 有些已嚴重超標(甘居利等, 2009; 劉敏霞等, 2013)。這些污染物一般通過地表徑流、工業廢水和大氣沉降等各種途徑進入生物體內, 即使濃度極低, 在魚、貝類等低營養級生物的脂肪中被富集和放大, 不僅影響水生生物的生長、發育和繁殖, 也對食物鏈高層生物包括人類及其它高等動物形成危害(梁恕坤, 2009; 彭艷超等,2010; 李娜等, 2012)。目前可通過檢測貝類等水產品軟組織中富集的有機污染物含量來反映水體被污染的程度。因此, 對其在水產品中的檢測研究非常必要。

目前多氯聯苯的檢測方法主要有以下幾種: 免疫測定方法(陳寒玉等, 2011), 熒光檢測方法(Wanget al, 2010), 氣相色譜分析法(楊左軍等, 2011), 氣質聯用分析法(王道瑋等, 2013), 液相色譜分析法(張琦等,2009; 邢紅等, 2015)等。這些方法儀器昂貴, 需要在穩定的環境下進行檢測, 而且樣品前處理比較復雜,不能滿足社會發展的需求。

本文主要采用電子鼻對青蛤軟組織中的多氯聯苯進行快速檢測, 用線性判別式分析(LDA)、主成分分析(PCA)對結果進行定性定量研究, 運用歐式距離、馬氏距離、判別函數法和相關性, 對不同濃度的PCB15海水所養殖的青蛤樣品進行檢測和判別, 并利用HS-SPME-GC-MS檢測技術加以驗證(Ameeretal,2005; 徐亞丹等, 2006)。

1 材料與方法

1.1 材料

青蛤(Cyclina sinensis)購于寧波大學農貿市場。標準品 PCB15, 濃度為 10 μg/mL, 購自德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。手動SPME進樣器、65μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯(PDMS/DVB)涂層萃取頭,購于美國SUPELCO公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 青蛤購回后, 立即清洗去除殼上附著物, 剔除死亡及有破損的個體。按大小隨機分為5組。置于海水中暫養2 d, 為了避免排泄物及食物對實驗可能造成的影響, 暫養和前處理期間均不喂食。兩天更換一次海水, 同時除去死亡個體。水溫在18—25°C, 氣泵加氧。

實驗組根據海水中PCB15濃度分為5組, 每組50只青蛤, PCBs濃度依次為0、0.005、0.1、0.5和1μg/L;在此期間, 每兩天更換海水一次, 每天查看、記錄死亡情況, 并及時去除死亡個體和清理殼體附著物。當青蛤長時間保持開殼狀態, 用細玻棒碰觸殼體和軟組織而無反應者, 可判斷為已死亡。整個實驗過程持續8d, 依次在處理72 h和144 h時取樣測定, 每次平均取樣10只。用于電子鼻和氣質聯用測定。

用手術刀將五組青蛤直接撬殼, 取出軟組織, 剪碎, 稱0.4 g放入15 mL螺紋樣品瓶中, 擰緊瓶蓋。每組5個平行, 用于電子鼻及后續氣質聯用的測定。

1.2.2 電子鼻檢測

檢測: 將各樣品瓶在55—60°C恒溫水浴中加熱保溫30min, 室溫下冷卻15min, 使瓶中頂空氣體平衡后利用電子鼻(PEN 3, Airsense公司, 梅克倫堡州, 德國)檢測, 數據采集時間為200s, 清洗時間為300s, 進氣量為300mL/min。

數據分析: 運用電子鼻配套的WinMuster軟件對電子鼻采集的樣品數據進行主成分分析(PCA)以及線性判別分析( LDA)。

1.2.3 HS-SPME-GC-MS測定

萃取: 將萃取頭在氣相色譜的進樣口 250°C, 老化0.5h后, 插入樣品瓶于55°C水浴吸附30min, 然后用氣質聯用儀(GC-MS聯用儀, 美國安捷倫科技公司,北京普析通用儀器有限責任公司)進樣口于 220°C解吸附5min, 啟動氣質聯用儀采集數據。

色譜條件: DB-5毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×2.5 μm); 載氣He, 流速1 mL/min; 不分流模式進樣,進樣時間3 min, 恒流1 mL/min; 進樣口溫度: 220°C,程序升溫: 起始柱溫120°C保持4 min, 15°C/min 升至280°C, 保留3 min。

質譜條件: 離子源為電子轟擊源(EI), 電離電壓70 eV, 離子源溫度250°C, 傳輸線溫度為280°C, 掃描范圍45—450 u。

數據分析: 通過計算機檢索NIST譜庫相互匹配進行定性分析, 對譜庫中化合物相似度高于80的組分加以標定, 按照峰面積歸一化法計算各組分相對百分含量(何紅萍等, 2013a, b)。

2 結果與分析

2.1 電子鼻檢測結果

2.1.1 青蛤PCB15的模版建立 圖1a和圖1b為處理72h和144h青蛤軟組織中PCB15檢測結果, 其中每個橢圓代表一個所檢測到的PCB15濃度, 橫坐標、縱坐標分別表示在LDA轉換中得到的LD1(判別函數1)和LD2(判別函數2)以及PCA轉換中得到的PC1(第一主成分)和PC2(第二主成分)的貢獻率。從圖1a可以看出, 第一判別式函數方差貢獻率LD1與第二判別式函數方差貢獻率LD2分別為54.44%和33.65%,總貢獻率為88.09%; 從圖1b看出, 第一、二主成分PC1、PC2分別為75.29%和17.25%, 總貢獻率達到92.54%?？梢? PCA的分析效果優于LDA, 具有更高的分辨率。

圖2a、圖2b分別為144 h后PCB15在青蛤軟組織中殘留的LDA、PCA分析圖。從圖2a可以看出, 樣品處理144h后, 第一判別式函數方差貢獻率LD1與第二判別式函數方差貢獻率LD2分別為78.82%和10.24%,總貢獻率為89.06%; 從圖2b看出, 第一、二主成分PC1、PC2分別為75.29%和17.25%, 總貢獻率達到92.54%。PCA的分析效果優于LDA, 不同濃度PCB15在PCA分析圖中能夠完全分開。在LDA分析圖中呈現有一定的聚類特性, 空白組與0.05μg/L組在空間分布上有微小的交集, 當濃度達到0.1μg/L以上時區分效果很明顯。PCA的分辨效果明顯優于LDA, 電子鼻的PCB15濃度的檢測限最低為0.05μg/L。

圖3a、圖3b是電子鼻采集到的不同時間處理后PCB15在青蛤軟組織中殘留的LDA、PCA分析圖, 總貢獻率分別為90.99%、88.28%, 第二主成分貢獻率PC2明顯升高, 達到23.14%?？梢钥闯霾煌瑵舛冉M基本沒有交集, 還是能夠明顯區分開來。說明PCB15濃度隨著作用時間的延長, 氣味會發生明顯變化, 但是濃度仍可以區分。綜合圖1、圖2和圖3的分析結果, 青蛤的氣味雖受作用時間影響, 但是還在一個氣味區域中。因此, 無論作用時間如何變化, 電子鼻都能夠準確地識別出青蛤軟組織中PCB15的濃度。

圖1 處理72h的青蛤軟組織中PCB15的LDA和PCA分析結果Fig.1 LDA and PCA score plots of PCB15 in 72h from C. sinesis soft tissue a. LDA分析圖; b. PCA分析圖

圖2 處理144h的青蛤軟組織中PCB15的LDA和PCA分析結果Fig.2 LDA and PCA score plots of PCB15 in 144h from C. sinensis soft tissue a. LDA分析圖; b. PCA分析圖

圖3 青蛤PCB15的LDA和PCA分析模板Fig.3 LDA and PCA score plots of PCB15 in C. sinensis a. LDA分析圖; b. PCA分析圖

2.1.2 青蛤PCB15模版的驗證和各個濃度的識別 分別取不同濃度下PCB15海水中培養108h的青蛤樣品,用判別函數分析(DFA)法驗證模板的準確性, 由圖4—圖8可以看出, 不同種類的待測樣品的氣味曲線穿過PCB15模板各濃度到達和自己相近的濃度終點,經過電子鼻分析, 對待測樣品進行歸類以及判定, 找到樣品所屬的數據區域(圖4), 從而判定待測樣品所屬濃度。歐氏距離、相關性、判別函數法、馬氏距離等方法的鑒別率分別為100%、92%、96%、92%。四種方法總的鑒別率均達到90%以上, 能夠較準確地對電子鼻結果進行驗證(見表1)。

圖4 空白組的識別結果Fig.4 Validation results of control check

圖5 PCB15濃度為0.05μg/L的識別結果Fig.5 Validation results of 0.05μg/L

圖6 PCB15濃度為0.1μg/L的識別結果Fig.6 Validation results of 0.1μg/L

圖7 PCB15濃度為0.5μg/L的識別結果Fig.7 Validation results of 0.5μg/L

圖8 PCB濃度為1μg/L的識別結果Fig.8 Validation results of 1μg/L

表1 4種模型對PCB15濃度識別結果Tab.1 Identification results of PCB15 concentrations in four models

2.2 GC-MS檢測結果

青蛤軟組織勻漿中添加不同濃度的PCB15, 測定各濃度相應的峰面積并以其為縱坐標, 以濃度為縱坐標繪制標準曲線。其中, 回歸方程是y=7248.32x–135.09,R2= 0.9998。表2是根據方程所得的定量值、相對誤差和回收率?？梢钥闯? 在各濃度水平下, 相對誤差在3.8%—18%, 回收率保持在85%—118%之間。

表3是青蛤軟組織中PCB15作用一段時間后的GC-MS檢測結果, 通過外標法定量。從表3可以看出,在PCBs濃度低于0.1μg/L的海水中養殖的青蛤軟組織中沒有檢測到PCB15。

表2 GC-MS檢測方法的回收率Tab.2 The recovery rate of GC-MS detection method

表3 青蛤PCBs的GC-MS檢測結果Tab.3 The detection results of GC-MS for PCBs in C. sinensis

3 討論

電子鼻能夠快速檢測青蛤軟組織中的多氯聯苯,檢測限可以達到 0.05μg/L, 檢測時間僅用 10min。采用LDA和PCA分析, 建立多氯聯苯的濃度識別模板;在處理方法相同的情況下, PCB15作用72 h組的PCA的分析效果優于LDA, 具有更高的分辨率; 而144 h組的 PCA的分析效果同樣優于 LDA, 區分效果較72h組的更好。說明處理時間對電子鼻更高效的檢測青蛤軟組織中的多氯聯苯有重要作用, 隨著處理時間的延長, 兩種方法的總貢獻率越高, 辨別效果越好,推測這可能與貝類對海水中多氯聯苯的富集作用有關。運用歐氏距離、馬氏距離、判別函數法和相關性對樣品中 PCB15濃度進行鑒別驗證, 四種方法總的鑒別率也均達到 90%以上, 可以較準確地對樣品進行檢測。

在電子鼻檢測青蛤軟組織多氯聯苯時, PCA分析效果明顯優于LDA分析。PCA主要是從特征的協方差角度去找到比較好的投影方式, 因此不同濃度組的樣本能夠有明顯差異, 區分效果較為明顯。而LDA更多的是考慮了標注, 即希望投影后不同類別之間數據點的距離更大, 同一類別的數據點更緊湊。概括來說, PCA選擇樣本點投影具有最大方差, LDA選擇分類性能最好。LDA的缺點是抗干擾容錯能力差, 不能保證最大程度排除青蛤在培養過程中環境的變化。而當樣本數據較多, 需要驗證判別未知樣品歸類或者濃度時, 考慮到標注的 LDA分析分類效果要優于PCA分析。因此兩者各有利弊, 應該結合使用(張亮等, 2013)的分析方法。

用氣質聯用分析青蛤軟組織中的多氯聯苯濃度時發現: 青蛤在海水中PCB15濃度為0.5μg/L以上時才能在軟體中檢測到。HS-SPME-GC-MS檢測方法相對誤差在3.8%—18%的區間內。而電子鼻歐氏距離、相關性、判別函數法、馬氏距離等方法的鑒別率均達到 90%以上, 與 HS-SPME-GC-MS的檢測結果相比,效果更好。在實際應用中, 電子鼻的最低檢出限0.05μg/L要比GC-MS的0.5μg/L要低, 說明電子鼻適用于貝類產品中的多氯聯苯污染的快速檢測。為了提供更可靠的依據, 可以把電子鼻檢測與 GC-MS方法結合起來, 分析出海水中不同有害物質存在下貝類的特征揮發性物質及其所占的比例, 從而為貝類監督檢驗提供參考。

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