東海陸架表層沉積物細菌群落結構及地理分布研究*

劉明華 王健鑫 俞凱成 蔣 然 劉曉輝 王帥兵 劉雪珠

(浙江海洋學院海洋微生物生態與應用實驗室 舟山 316022)

海洋占據了地球總面積的71%, 擁有豐富的生物資源。微生物在海洋環境中扮演著重要角色, 包含細菌、真菌、放線菌及病毒在內的海洋微生物不僅為地球提供了近一半的初級生產力, 為現代工業生產提供了重要的天然藥物和酶資源(Arrigo, 2005),同時參與物質和能量循環(Simmonset al, 2008), 影響全球氣候變化(Azamet al, 2004)。海洋沉積物是地球上面積最大的覆蓋層, 具有低溫、高壓、寡營養和無光照等極端環境特征, 孕育了大量特殊生理特性的微生物類群, 成為地球上最復雜的微生物棲息地, 并在整個海洋生態系統的生物地球化學循環過程中發揮著重要的作用(K?steret al, 2008)。因此開展海洋沉積環境中微生物資源及其多樣性研究是海洋微生物從資源走向應用的關鍵(劉玉娟等,2014)。

東海是西太平洋構造活動帶中一個大型邊緣海,處于 21o54′—33o17′N, 117o05′—131o03′E 之間, 是西太平洋溝-弧-盆體系的典型發育地區(李家彪, 2008)。東海海域的水文狀況及沉積動力環境較為復雜, 碎屑沉積物的搬運和沉積作用主要取決于沉積動力條件。東海海流系統主要由黑潮、臺灣暖流、東海沿岸流, 即外來的黑潮流及其分支和當地生成的沿岸流等組成(李萬超, 2008)。典型的地質構造和多重的海流組成使得東海陸架不僅是研究生物地球化學循環的重要區域, 也是研究海底各種沉積作用和微生物群落多樣性的有利場所。關于東海微生物多樣性的研究, 早期多集中在表層海水環境和可培養微生物(鄭國興等, 1982; 宋志剛等, 2006; 盧婧雯等,2012), 近年來關于陸架沉積物微生物的研究成為新的熱點領域(Parket al, 2008; 張東聲, 2011; 杜萍等,2012; 王健鑫等, 2012; 有小娟等, 2013), 當然采樣區域、時間、方法以及研究對象、技術手段、結果都各有側重。

海洋環境中絕大多數微生物都是處于未可培養的狀態(Arakakiet al, 2010), 影響了對環境微生物的深入研究。隨著近幾年分子生物學技術的普及, 從DNA水平研究微生物的多樣性已成為當前研究最主要的技術手段, 并推動了微生物海洋學的快速發展(Venteret al, 2004)。本文采用16S rRNA 基因克隆測序, 對東海陸架五個站點(DH6, DH9, DH16, DH17,DH21)沉積物樣品進行細菌種群多樣性、群落結構和地理分布規律進行初步探討, 以期為東海陸架沉積環境微生物分子生態學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

海洋沉積物樣品采集自 2007年 4—5月海洋調查項目, 五個采樣站點的位置信息如表 1和圖 1所示。沉積物柱芯樣品采集后立即分裝于無菌樣品袋中, ?20°C保存于科考船冰柜中, 后置于實驗室?80°C超低溫冰箱中長期保存, 沉積物主要以中細砂為主。

表1 各采樣點信息Tab. 1 The information of five sites

圖1 各采樣站點分布示意圖Fig.1 Map of five sampling sites

1.2 樣品總DNA的提取與純化

利用FastPrep?-24快速核酸提取儀(MP Biomedicals公司)和 Fast DNA spin kit for soil 試劑盒進行沉積物樣品DNA提取, 核酸蛋白檢測儀(Bio-Rad公司)測定DNA濃度和純度,純化后用于 PCR擴增。

1.3 PCR擴增和產物回收

將樣品總DNA在梯度PCR儀(Biometra公司)中進行擴增,所用引物為 341F (CCTACGGGAGGCAG CAG)和 907R (CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)。50μL PCR 擴增體系: DNA 模板 1μL, 反應引物 341F(10μmol/L)和 907R (10μmol/L)各 1μL, 10×PCR buffer(含 MgCl21.5mmol/L) 5μL, dNTP (2.5mmol/L) 5μL,rTaq 聚合酶(5U/μL) 0.5μL, ddH2O 36.5μL。PCR 擴增循環條件為: 94°C預變性5min; 94°C變性30s, 55°C退火40s, 72°C延伸40s, 35個循環; 最后72°C延伸7min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR擴增結果, 對條帶(500—750bp)進行割膠, 用 DNA 膠回收試劑盒(QIAGEN公司)回收產物。

1.4 克隆子篩選和測序

PCR割膠回收產物連接pMD-18T(TaKaRa)載體,轉化于Escherichia coliDH5α感受態細胞。經藍白斑篩選, 挑取白斑進行液體培養過夜, 再通過菌液PCR進行擴增, 擴增 10μL 體系為: Extaq 5μL, ddH2O 4.1μL, 341F (10μmol/L)和 M13R (10μmol/L)各 0.2μL,菌液0.5μL。PCR擴增循環條件為: 95°C預變性5min;94°C 變性 1min, 58°C 退火 40s, 72°C 延伸 40s, 35個循環; 最后72°C延伸10min。電泳檢測, 選取500—750bp之間的克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司進行檢測。

1.5 序列分析

將序列提交到 RDPⅡ數據庫, 利用在線工具CHECK-CHIMERA檢測嵌合體; 應用 BLASTN程序搜索相似性序列, 進行系統發育分析。采用ClustalX (Version 1.8)進行序列比對分析, 通過MEGA 5軟件里Neighbor-joining法構建系統發育樹(Kumaret al, 2004)、利用 DOTUR軟件確定分類單位(OTU)(Schlosset al, 2005)。細菌16S rDNA序列在GenBank核苷酸數據庫中的接受號為 KR086422-KR086717。

2 結果與分析

2.1 細菌16S rDNA文庫數據分析

對公司返回的序列進行去載體和嵌合體處理,共得到 508有效克隆子, 通過 DOTUR 軟件分析,將相似度大于97%的有效克隆子歸為一個OTU, DH6、DH9、DH16、DH17和DH21五個站點的OTU分別為47、82、36、69和86, 并獲得五個站點各自的Biascorrected Chao 1、ACE豐富度指數、香農指數(H′)和辛普森指數(D)(如表2所示)。利用生成的Rarefaction數據, 制作稀釋性曲線(圖2)。

表2 東海陸架表層沉積物細菌多樣性指數Tab. 2 The bacterial diversity index from the surface layer sediments of the East China Sea

圖2 東海站點克隆文庫稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve from five sampling sites of the East China Sea

文庫分析結果表明: DH21和 DH9兩個站點的Bias-corrected Chao 1和ACE豐富度指數顯著高于其它三個站點; 而辛普森指數(D)顯著低于其它三個站點, 可見DH9和DH21站點多樣性較高, DH17站點次之, DH6和DH16兩個站點的多樣性最低。從稀釋曲線上來看, 五個站點多樣性由高到低排列依次為:DH9>DH21>DH17>DH6>DH16, 與指數分析結果基本一致; 隨著克隆子數量的增加, 稀釋曲線的斜率有一定程度的減小, 但DH9、DH21和DH17三個站點的斜率仍然較大, 說明克隆子和 OTU的數量還沒有覆蓋站點細菌多樣性的真實范圍。

2.2 細菌群落結構分析

圖3 東海各站點表層沉積物菌群組成Fig.3 Composition of clone libraries for surface layer sediments in five sites of the East China Sea

對返回的DNA序列參考NCBI Taxonomy上的分類方法, 變形菌門以“綱”為分類單位, 其它細菌以“門”為分類單位, 共得到包括變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospira)、WS3、擬桿菌門(Bacteroidetes)、螺旋體門(Spirochaetes)、OP8、浮霉菌門(Planctomycetacia)、疣微菌門(Verrucomicrobiae)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)等 13個類群, 其中變形菌門包含 α-變形菌綱(Alpha-proteobacteria)、β-變形菌綱 (Beta-proteobacteria)、 γ-變 形 菌 綱 (Gammaproteobacteria)和 δ-變形菌綱(Delta-proteobacteria),五個站點的細菌多樣性及群落組成結構如圖3所示。

由圖3可知, 變形菌門是東海陸架沉積物中的優勢菌群, DH6、DH9、DH16、DH17和DH21五個站點變形菌門的 OTU數占總 OTU的百分比分別為51%、23%、44%、48%和50%。在變形菌門中, γ-變形菌和 δ-變形菌是兩個主要的典型類群, 但在不同的站點, 其豐度也存在一定的差異: DH6和DH16站點 γ-變形菌豐度高于 δ-變形菌, 而 DH9、DH17和DH21站點的δ-變形菌豐度又明顯高于γ-變形菌。α-變形菌在各個站點也均有分布, DH21站點的α-變形菌豐度最高(含13個OTU, 占比為15.1%), DH17站點的 α-變形菌豐度次之(8個 OTU, 占比為 11.6%),DH6、DH9和DH16站點豐度較低。β-變形菌豐度最低, 只有在DH9和DH21兩個站點有分布, 分別占總OTU的3.7%和1.1%。

除了優勢菌群外, 厚壁菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和放線菌門在各個站點均有分布, 其豐度和多樣性差異較大。厚壁菌門在 DH16站點的豐度最高(占16.4%), DH9站點次之(12個 OTU, 占比 14.6%), 其它三個站點均在7%以下。綠彎菌門在DH17站點的豐度最高(占比17.4%), DH9和DH16站點也有較高的豐度(分別為 17.1%和13.9%), 而DH6和DH21站點綠彎菌所含比例僅為 4.2%和 4.7%。另外, 酸桿菌門在各個站點的豐度并不高, 除 DH6站點的占比達到12.8%外, 其它站點豐度均在 10%以下; 而放線菌門在 DH21站點(14個 OTU)豐度最高, 占總 OTU的15.1%。

還有一些門類并不是所有站點都有分布, 且豐度普遍較低。如硝化螺旋菌門只在DH6、DH9和DH21站點分布, 占比分別為2.1%、2.4%和5.8%; WS3只存在于 DH6站點, 占比為 4.3%; 擬桿菌門只存在于DH6和DH21兩個站點中, 占比分別為4.2%和1.2%;螺旋體門和浮霉菌門存在于DH9、DH17和DH21站點, 都只有唯一的OTU分布; OP8在DH16和DH17站點各有一個OTU分布; 芽單胞菌門只在DH9站點有一個 OTU分布; 疣微菌門也只在 DH21站點有一個OTU分布。另外5個站點還有8.3%—20.7%的分類地位不確定的微生物。

2.3 16S rRNA基因序列的系統進化分析

2.3.1 DH6站點系統發育樹分析 DH6站點的105個有效克隆子可分為11個細菌類群(圖4), 其中γ-變形菌綱占47個OTU的36%, 是該站點的優勢菌群, 以基因型DH61B3(38個克隆子)為代表的序列與愛琴海沉積物嗜冷桿菌(Psychrobactersp. 3BM13Y12)同源性較高(99%), 基因型DH61B46與東海陸架沉積物未培養γ-變形菌DH133B19克隆有高同源性(99%),基因型 DH62B33與大洋地殼不可培養 γ-變形菌P0X4b3H08克隆有高同源性(99%), DH61B56序列和澳大利亞大堡礁附近沉積物未培養 γ-變形菌 R76-92克隆相似度達 99%。δ-變形菌在 DH6站點也有一定分布, 基因型 DH61B39與比塞大瀉湖(突尼斯)沉積物未培養 δ-變形菌 2C48克隆有高同源性(99%),DH62B39序列與沖繩中部槽伊平屋村北場深海熱液噴口附近沉積物未培養δ-變形菌IBP10m-6克隆有高同源性(99%)。α-變形菌則以基因型DH62B34為代表,其序列與來自海洋死亡區(最小含氧區)的未培養細菌SGSX1079克隆同源性最高(100%)。

酸桿菌門有6個OTU, 代表基因型DH61B48與南大西洋海岸線沙灘的未培養細菌LC3-26克隆高同源性(99%)。擬桿菌門在東海含量較低(2個克隆子),代表基因型DH62B28序列和南太平洋東勞擴張中心(ELSC)的深海熱液區未培養 Bacteroidetes bacterium clone 44有高同源性(99%)。放線菌代表基因型DH62B38序列與西南印度洋中脊沉積物中未培養細菌T13J-B77克隆同源性較高(99%)。綠彎菌門代表基因型DH62B36序列與東太平洋中國結核區的未培養細菌ES0303-B80克隆同源性高(99%)。厚壁菌代表基因型DH61B16(2個克隆子)與青藏高原湖泊細菌未培養細菌Fi09-23克隆具有高相似性(99%)。硝化螺旋菌在該區有少量分布, DH61B60序列與香港維多利亞港沉積物未培養Nitrospirae bacterium VHS-B4-29克隆有較高的同源性(99%)。WS3是DH6站點特有的類群, 其 DH62B29序列與法屬圭亞那海岸的未培養細菌克隆5_64具有很高的同源性(99%)。

2.3.2 DH9站點系統發育樹分析 從DH9站點的系統發育樹中可以發現, 變形菌門雖豐度不高, 但覆蓋了 4個綱(圖 5所示)。δ-變形菌其代表基因型DH94B1與西班牙西北海岸謝斯群島漏油區域未培養細菌 ANOX-036克隆序列有高同源性(99%), 基因型 DH94B15序列與馬洛卡島(地中海附近海域)原油污染響應的未培養硫酸鹽還原菌(SRB)MS-B135克隆相似度較高(99%), 這與 δ-變形菌綱一些種類可以在厭氧條件下還原硫酸鹽的性質相符。β-變形菌代表基因型DH92B6與黃瓜根際未培養細菌HG-J0184克隆同源性高(99%), 另外基因型 DH91B8與長江口崇西濕地蘆葦根際未培養細菌 P-B269克隆同源性較高(98%)。γ-變形菌和 α-變形菌在該站點只有很少的類群存在, 其中代表基因型 DH94B16序列與椒江口沉積物未培養 γ-變形菌克隆 C6_54同源性高(99%),DH91B9序列與法屬圭亞那海岸沉積物未培養 α-變形菌克隆4_165相似性較高(99%)。

圖4 DH6站點系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree for DH6 site

圖5 DH9站點系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree for DH9 site

綠彎菌門和厚壁菌門是 DH9站點的兩個主要類群, 分別占 17%和 14%。綠彎菌門類群中的基因型DH94B17與非洲中部坦噶尼喀湖沉積物的未培養細菌TK-SH18克隆同源性較高(99%), 基因型DH92B21與法屬圭亞那海岸沉積物未培養綠彎菌 4_211克隆具有較高親緣性(99%), 基因型DH92B17與希臘克里特島海域沉積物未培養細菌HCM3MC78_11C_FL克隆同源性較高(99%)。厚壁菌門類群中代表基因型DH92B22序列(2個克隆子)與斯瓦爾巴特群島Austre Lovénbreen冰川樣品的未培養細菌IC4141克隆同源性較高(99%), DH94B20序列與含烴蓄水層的Pelotomaculumsp. clone 2_100_C12_b有高同源性(相似度99%)。

硝化螺旋菌門共有兩個 OTU, 基因型 DH93B24序列與地中海瀉湖石油污染沉積物中的可培養Nitrospirasp. clone 80同源性較高(99%), DH94B6序列與同樣來自東海沉積環境的未培養細菌 DH132B19克隆同源性達99%。螺旋體門中的DH 92B14序列與珠江口沉積物未培養細菌 BotBa23克隆有很高的同源性(99%)。酸桿菌門在該站點有分布, 其中基因型94B29序列與南沙海灣養殖區沉積物的未培養細菌 OTU88克隆同源性較高(99%)。芽單胞菌門是DH9站點特有的菌群, 其代表基因型 DH91B12與黃海大陸架沉積物Gemmatimonadetes bacterium clone JJB215相似度達99%。

2.3.3 DH16站點系統發育樹分析 由圖 6可知,DH16站點中 γ-變形菌綱含量最高, 其中代表基因型DH161B1(38個克隆子)與椒江口沉積物未培養細菌C5B01克隆的同源性最高(100%), 基因型DH162B12與挪威斯瓦爾巴特群島水樣中的未培養軍團菌目克隆Legionellales bacterium SSIM-D10具有很高的同源性(99%), 基因型 DH162B56與南大西洋拉普拉塔河的沉積物未培養細菌克隆 γ-proteobacterium ARTE12_226的親緣性比較近(99%)。另外還有少量的δ-變形菌克隆子, 其代表基因型DH162B19 (3個克隆子)與馬洛卡沙性沉積物中的未培養細菌 MS-K53克隆具有很高親緣性(100%)。

圖6 DH16站點系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree for DH16 site

厚壁菌門的含量僅次于 γ-變形菌綱(7個 OTU),該類群的基因型 DH162B34序列與地中海馬洛卡島沿岸附近的沉積物層未培養梭菌目克隆 Clostridiales bacterium MS-A191的相似度最高(100%), DH162B26序列則與地中海東部深海未培養克隆子 Fimicutes bacterium M71_D94表現出高同源性(99%)。放線菌在該區域只有3個OTU分布, 其中DH162B32序列與北海區域的沉積物未培養放線菌 BAC-OG90相似度最高(100%)。DH162B2序列與南沙海灣的網箱養殖區域沉積物酸桿菌克隆子Acidobacteriumsp.OTU104的同源性高達 100%。綠彎菌門在該站點有分布, 其中DH162B53序列與摩卡島淺甲烷冷泉附近未培養克隆子Anaerolineaceae bacterium isolate DGGE gel band 2有高的同源性(100%)。DH16站點還有獨特的OP8類群分布, 其基因型DH162B6與香港維多利亞港未培養沉積物細菌candidate division OP8 bacterium VHS-B3-2克隆同源性為100%。

2.3.4 DH17站點系統發育樹分析 γ-變形菌綱和δ-變形菌綱是DH17站點兩個主要的類群(圖7), 其中γ-變形菌綱的代表基因型 DH172B7(5個克隆子)意大利里窩那港海底沉積物未培養細菌isolate 1.2, clone 140有較高同源性(98%), DH173B23序列和墨西哥Alchichica鹽堿湖的未培養細菌 Alchichica_AQ1_1_1B_07克隆同源性比較高(99%); δ-變形菌綱中的基因型 DH171B20(3個克隆子)序列與意大利里窩那港海底沉積物的未培養細菌isolate 2.1, clone 59b克隆有較高同源性(99%), 基因型 DH173B46與南沙海灣養殖區沉積物的未培養細菌 OTU146克隆有很高親緣性(99%)。α-變形菌綱類群中 DH173B41序列與甲基桿菌Methylobacterium komagataen23e-3序列親緣性比較高(99%), DH173B12(3個克隆子)序列與 α-變形菌綱中的未培養醋桿菌 Acetobacteraceae bacterium AMIG7克隆相似度為99%。

圖7 DH17站點系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree for DH17 site

綠彎菌門在該站點的含量比較豐富, 其中代表基因型DH171B9(6個克隆子)與坦噶尼喀湖得到的未培養細菌 TK-SH18克隆具有較高的同源性(97%),DH172B23序列與墨西哥大陸坡海灣的未培養細菌IODP1320B2H7.13克隆具有高同源性(99%), 基因型DH173B15序列則和廈門紅樹林沉積物未培養細菌XME13克隆相似度為99%。酸桿菌門類群中的基因型 DH172B10序列與日本竹富島海底熱液環境中的未培養細菌 pItb-vmat-12克隆具有高度同源性(99%)。厚壁菌門的代表基因型DH171B13序列與地中海馬洛卡島沿岸附近的沉積物未培養梭菌目 MSC192克隆的相似度最高(99%)。螺旋體門和浮霉菌門在 DH17站點分布較少, 螺旋體門代表基因型DH172B3序列與日本下北半島的海底沉積物中未培養細菌 C9001C_B01_1_C047克隆具有高同源性(99%); 浮霉菌門代表基因型 DH172B14與南沙海灣養殖區沉積物的未培養細菌 OTU97克隆相似性達99%。OP8在該站點也有分布, 其基因型 DH172B15與法屬圭亞那海岸沉積物未培養細菌 1_145克隆具有很高親緣性(99%)。

2.3.5 DH21站點系統發育樹分析 由圖 8可知,DH21站點的細菌多樣性非常豐富。δ-變形菌綱在該站點的豐度較高, 代表基因型DH211B18(3個克隆子)與膠州灣未培養沉積物細菌JBS_E404克隆高度同源(100%), 基因型DH216B6(2個克隆子)和DH213B2(5個克隆子)序列分別與西班牙西北海岸謝斯群島漏油區域獲得的未培養細菌OXIC-088和RODAS-105克隆高度同源(100%)。α-變形菌綱中的代表基因型DH212B2(6個克隆子)與鹽堿土壤未培養生絲微菌克隆Hyphomicrobiumsp. HAHS13.66同源性很高(99%),DH211B16序列與印度西部阿拉伯海岸坎貝灣沿岸土壤細菌ONGS204克隆有高同源性(98%), DH215B2序列與南大西洋海岸線的海洋沙灘未培養細菌 LC1-34克隆高度同源(100%)。γ-變形菌綱的代表基因型DH215B12(3個克隆子)與意大利里窩那港海底沉積物未培養細菌isolate 1.2,clone 147同源性高達100%,DH213B14序列和同樣來自西班牙西北海岸謝斯群島漏油區域沉積物的未培養細菌 PET-057克隆高度同源(100%)。β -變形菌在該站點分布很少, 且得到的序列DH216B13與地中海海綿區未培養細菌Nitrosospirasp. Msd8克隆高度同源(100%)。

圖8 DH21站點系統發育樹Fig.8 Phylogenetic tree for DH21 site

放線菌門在該站點比較豐富, 代表基因型 DH214B16與希臘南部克里特島的附近好氧沉積物未培養細菌HCM3MC80_9D_FL克隆具有很高的親緣性(100%),另外基因型 DH216B10相似度很高的序列來自北海(54°4'N/4°E)區域沉積物, 與未培養細菌 isolate DGGE gel band BAC_OG90克隆同源性高達100%。酸桿菌門在 DH21站點分布同樣較多, 基因型DH215B6序列與西班牙西北海岸謝斯群島漏油區域沉積物的未培養細菌 PET-051克隆同源性最高(100%), 基因型 DH215B13與來自東海陸架 DH-17站點表層沉積物未培養細菌 DH132B07克隆同源性較高(98%)。擬桿菌門的代表基因型DH214B14序列與南湯加弧火山 1號口的淺層熱液噴口的未培養細菌 V1B07b75克隆具有很高的同源性(99%)。硝化螺旋菌門以DH214B11為代表, 有5個克隆子, 其序列與西班牙西北海岸謝斯群島漏油區域沉積物的未培養細菌ANOX-094克隆同源性高達100%。浮霉菌門和螺旋體門在 DH21站點都只有一個 OUT分布, 其中浮霉菌代表序列DH211B11與墨西哥Alchichica鹽堿湖的未培養細菌 Alchichica_AL52_2_1B_131克隆同源性高達 100%; 螺旋體門代表基因型 DH216B15序列與埃布羅、卡馬格三角洲未培養細菌 LH042克隆親緣性很高(100%)。疣微菌是DH21站點的特有類群, 其基因型 DH212B9序列與普羅旺斯 Etangde-Berre瀉湖沉積物未培養細菌13bis T0h-oil克隆高度同源(100%)。

3 討論

3.1 典型優勢菌群豐度和地理分布

變形菌門一直被認為是海洋表層沉積環境中的優勢細菌類群, 一般都超過微生物生物量的 50%以上(Ravenschlaget al, 2001; Bowmanet al, 2003), 但在不同海域表層沉積物基因文庫中所占的比例差異較大, 如卡斯卡底古陸邊緣次表層沉積物中變形菌門含量占文庫比例高達 95% (Marchesiet al, 2001),而在日本Nankai海槽1176站位次表層沉積物中, 變形菌門僅占基因文庫的22% (Kormaset al, 2003)。關于變形菌在東海陸架表層沉積物中是否為典型優勢菌群, 王健鑫等(2012)報道變形菌門占東海陸架表層沉積物細菌文庫的 41.5%; 張東聲(2011)研究長江口及鄰近海域的沉積物微生物中變形菌門占該海域基因文庫的 47.2%; 鄭艷玲等(2012)研究崇明東灘表層沉積物變形菌門占文庫的比例在 22.4%—34.6%; 本研究五個站點中有4個站點的變形菌門所占OTU數的比例接近或超過 50%, 說明變形菌門在東海區域是主要的細菌類群。

變形菌門不同綱的菌群在海洋沉積物中的豐度變化也是海洋微生物群落結構研究中的一個重要指標。王健鑫等(2012)研究表明γ-變形菌綱是優勢類群,占東海 DH-13站點區域基因文庫的 52%; Feng等(2009)對長江口和東海沿岸研究也認為沉積物中變形菌門以 γ-變形菌綱為主; 李友訓等(2008)對東太平洋深海沉積物的研究也認為 γ-變形菌綱是該沉積物的優勢菌群, 這些結果與本研究 DH6和 DH16相一致。但李濤等(2008)對南海西沙海槽地區的表層沉積物細菌多樣性的研究發現 δ-變形菌綱為優勢類群;郭建麗等(2013)對雙臺子河口沉積物中細菌多樣性研究表明δ-變形菌綱占基因文庫的60%, 為絕對優勢菌群, 這些結果與本研究DH9、DH17和DH21站點相一致。另外有研究表明δ-變形菌豐度的增加可能是與重金屬、石油烴等環境污染影響相關(Orcuttet al,2010; 李新偉, 2012; 郭建麗等, 2013), 本研究的DH9、DH17站點研究結果也與這一觀點相符。從地理位置看, DH9和DH17站點位于舟山市嵊泗列島附近, 周圍漁船較多, 人為活動也相對頻繁, 這些都可能引起重金屬和油污污染。

綠彎菌門是20世紀80年代才被認可的一個新的系統發育分支(Woeseet al, 1987), 研究表明其在深海的冷泉、海底深部玄武巖、熱液區等環境都有分布(Lysneset al, 2004; Reedet al, 2006), 被認為在低氧和厭氧環境中發揮重要作用。綠彎菌門在 DH9站點含量最高, 有著絕對優勢, 在 DH17站點含量次于最優勢菌δ-變形菌綱。分析兩個站點發現, DH9(綠彎菌門共14個OTU, 表層占3個)和DH17(綠彎菌門共12個 OUT, 表層占 2個)表層含有綠彎菌門比例分別為21.4%和 16.7%, 這似乎也表明綠彎菌適合生活在含氧量較低的沉積物環境中, 與陳明娜(2007)的研究結果相一致。

3.2 特殊類別細菌豐度和地理分布

疣微菌門是革蘭氏陰性細菌, 在海洋動物、南極沿岸沉積物和海水等環境中存在(Bowmanet al, 2003,2004; Sullivanet al, 2004), 能在厭氧條件下進行亞硝化作用(Freitaget al, 2003), 根據16S rRNA序列差異可將疣微菌門分為7個亞門(Schlesneret al, 2006), 但關于疣微菌門的研究還是很少。Freitas等(2012)對疣微菌門在全球海洋環境的分布和多樣性的研究發現,疣微菌在海洋沉積物細菌群落中占1.4%, Ⅰ型和Ⅳ型亞門是沉積環境中豐度最高的類群, 對海洋中碳的生物地球化學循環有著重要作用, 同時對沿岸多個站點的研究表明, 陸地徑流輸出不是影響沿岸海域疣微菌門豐度的主要原因。本實驗室前期研究發現疣微菌門在東海 DH-13站點的含量為 3.9%(王健鑫等,2012), 本研究表明疣微菌門是離岸最遠的 DH21站點的特有菌群(占比1.1%), 其豐度和地理分布基本和Freitas等(2012)的結果相一致。

芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)是土壤環境微生物的9大類群之一, 豐度占到土壤中細菌16S rRNA基因文庫的 0.2%—6.5%, 平均含量為 2.2% (Janssen,2006; DeBruynet al, 2011), 但目前正式命名的僅為一屬, 即芽單胞菌屬(Gemmatimonas), 代表菌種為Gemmatimonas aurantiacastrain T-27, 是一類革蘭氏陰性細菌, 通過出芽方式繁殖(Zhanget al, 2003)。芽單胞菌門在海洋沉積環境的研究并不多, Heijs等對地中海東部海底碳酸鹽風化殼的研究發現有Gemmatimonadetes序列存在; Durbin等(2011)對南太平洋深淵沉積環境的微生物群落進行研究, 發現Gemmatimonadetes在表層沉積環境豐度較高(7%—16%), 但隨著深度增加, 豐度快速減少; 另外根據16S rRNA序列將芽單胞菌門劃分為4個亞門, 其中Ⅱ型和Ⅳ型亞門偏好存在于海洋和鹽沼環境。芽單胞菌在本研究中存在于離岸最近的 DH9站點, 可能是由于長江和錢塘江等徑流沖刷陸地土壤后進入海洋沉積環境的結果。

Candidate division使用最初的來源地或最先命名的克隆子來命名各分支, 如OPx (x為數字)是根據黃石公園熱泉黑曜巖池塘(Obsidian Pool)而命名的(Hugenholtzet al, 1998)。Farag等(2014)通過 16S rRNA基因全序列分析, 將OP8分為4綱8目, 并發現該類群在烴類污染的環境中豐度較高, 其次是海洋生境(特別是熱液噴口和珊瑚礁), 水, 非海洋生境(尤其是地面泉水和地下水樣品); 陳明娜(2007)和李濤等(2008)分別對東西太平洋和南海的沉積物研究,均有發現該菌群, 本研究在DH16和DH17站點中也檢測到同源序列, 說明 OP8在不同海域沉積物中還是廣泛存在的。另一類Candidate division (WS3)只存在于 DH6站點, 早期研究認為該菌群與產甲烷環境有關(Dojkaet al, 1998), 王永霞(2014)在程海湖沉積物細菌多樣性研究也有報道, Lin等(2015)研究發現,WS3一些類群能夠形成硫復鐵礦磁小體, 在鐵和硫循環過程中扮演著未知的角色。

3.3 細菌群落結構與地質區域影響

東海陸架沉積環境錯綜復雜, 鄭國興等(1982)將東海陸架劃分為現代長江水下三角洲沉積區、現代淺海沉積區、濱海殘留沉積區、混合沉積區等不同地質區域。本研究的五個站點中, DH9和DH17位于現代長江水下三角洲沉積區, 且兩個站點都位于人類活動密集的區域, 受人為影響比較多; DH6和DH16位于濱海殘留沉積區, DH21站點位于混合沉積區。

隨著東部沿海地區經濟的發展和人類活動影響的加大, 陸源輸入使得東海的富營養化程度增加和環境污染加劇(王新等, 2010), 比如重金屬污染、化學物質污染、油氣田的開發、近海船塢的建設等都在持續影響著東海的近海生態環境平衡, DH9和DH17受其影響比較多, 細菌多樣性和豐度均較高, 有較多同源序列都與重金屬、化學物質和油氣污染相關。DH6和DH16位于濱海殘留沉積區, 該區域是黑潮暖流與臺灣暖流之間的過渡帶, 為外洋海水所控制, 沉積速率低, 營養不夠豐富, 故站點菌群的豐度不是很高,這與鄭國興等(1982)得出的在濱海殘留沉積區菌量最低的研究結果相一致。DH21站點是本研究離海岸最遠的站點, 其細菌多樣性和豐度都比較高(尤其是放線菌門), 可能與鄭國興等(1982)研究中的 G8023站點(離岸最遠海區)一樣, 受較高濃度的有機質、總氮含量影響, 同時該站點部分同源序列與油烴污染環境有關。

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