一株海洋生境芽孢桿菌FA08的篩選、鑒定及其酶學特性和抗菌性能分析*

方衛東 唐 旭 劉源森 林 凌 黃仕新 高培麗 徐長安①

(1. 集美大學水產學院 廈門 361021; 2. 福建省海新集團有限公司 漳州 363102; 3. 國家海洋局第三海洋研究所 廈門 361005)

隨著健康養殖業的發展, 有益微生物的應用越來越廣泛, 如在水產養殖過程中, 使用光合細菌、枯草芽孢桿菌等微生物制劑改善養殖環境, 降低疾病的發生, 取得了較好的效果(Vanittanakomet al, 1986;Burgesset al, 1993; Barsbyet al, 2001; Vaseeharanet al, 2003; 顧繼銳等, 2011; 張慶華等, 2011; 高存川等,2012; 潘娟等, 2012; 張峰峰等, 2012); 通過篩選生防細菌, 利用生防細菌對水產病原菌的抑制作用, 尋找替代抗生素的新途徑, 如從高度污染的海灘污泥中, 分離得到一株枯草芽孢桿菌 LHB02對三種弧菌包括哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)都有很強的抑制作用(徐長安等, 2011); 從不同生長階段的對蝦腸道中分離對病原菌(鰻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌)有拮抗作用的細菌(李海兵等, 2008)。另外專家學者也開展了利用益生菌、酶制劑促進水產養殖動物的健康和提高飼料利用率方面的研究(Tamehiroet al, 2002; Liuet al, 2010), 并取得了很好的試驗效果,如芽孢桿菌、低聚木糖、復合酶制劑及它們的配伍物可以促進異育銀鯽的生長, 提高飼料利用率, 促進腸道有益微生物的生長和抑制有害微生物, 并且能提高肝胰臟蛋白酶mRNA表達量和腸道酶活性(劉文斌等, 2007); 在飼料中添加糞腸球菌能夠促進羅非魚生長, 提高飼料利用率, 降低血清膽固醇和甘油三酯含量以及谷丙轉氨酶活性, 同時增加腸道乳酸菌數量,改善腸道微環境(周曉波等, 2014); 纖維素酶可降低動物胃腸內容物的粘稠度, 促進內源酶的擴散, 提高養分的消化吸收(胡喜峰等, 2004); 飼料中添加纖維素酶, 草魚增重率提高, 餌料系數降低, 干物質、粗蛋白、粗脂肪和粗纖維消化率都提高, 體成分沒有顯著變化(高春生等, 2006)。

目前, 同時具有產酶和抗菌性能的功能菌株篩選報道較少, 本實驗室在前期的功能菌篩選中, 篩選到一株既產纖維素酶又具有拮抗水產病原菌的芽孢桿菌, 本研究報道了該功能菌的篩選、鑒定, 及對功能菌產生的纖維素酶進行耐溫、耐酸堿和對紫外線的穩定性進行考察, 并開展功能菌對水產常見病原菌的拮抗效果分析, 初步評估該功能菌株的價值, 為以后開發該菌株提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

用于篩菌的樣品采自福建省寧德市養殖池底泥。

1.2 培養基

LB培養基: 蛋白胨10g, 酵母提取物5g, 氯化鈉10g, 水 1000 mL, pH 7.2—7.4。

SLB培養基: 蛋白胨10g, 酵母提取物 5g, 氯化鈉 10g, 瓊脂20g, 水1000 mL, pH 7.2—7.4。

產纖維素酶培養基: 蛋白胨 9.0 g、酵母膏 10.0 g,羧甲基纖維素鈉 5.0 g, 水1000 mL。

CMC-Na平板: 羧甲基纖維素鈉15.0 g、硫酸銨1.0 g、酵母膏1.0 g、硫酸鎂1.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、瓊脂20.0 g、水1000 mL, pH為自然值。

1.3 測試菌

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila), 愛德華氏菌(Edwardsiella), 哈維氏弧菌(Vibrio harveyi), 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus), 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

1.4 儀器設備

常規玻璃器皿、電子天平、超凈工作臺、打孔器、移液槍、臺式搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養箱,PCR儀, 核酸電泳儀, 凝膠成像儀, 多功能酶標儀和手提式紫外反射儀等。

1.5 功能菌的篩選

1.5.1 目標菌的分離 取 10g污泥樣品, 加入100mL 0.85% NaCl中, 攪拌后取上層濁液置于LB培養基, 37°C, 180 r/min, 富集培養 30h后, 菌液置于75°C水浴20min。水浴后的菌液進行梯度稀釋及平板涂布法進行分離。

1.5.2 功能菌產纖維素酶檢測 分別挑取初篩得到的目標菌, 標示為: FA01、FA02、FA03、FA04、FA05、FA06、FA07、FA08、FA09、FA10 等以此類推, 將這些目標菌置于LB培養基中, 37°C, 180 r/min,活化6 h, 活化好的菌液按10%接種至產纖維素酶培養基, 37°C, 180 r/min, 發酵 48h 后, 10000 r/min, 離心 6min, 棄去沉淀, 得上清液, 為粗酶液; 采用CMC-Na平板, 打孔后, 孔內添加 50μL所得的上清液, 之后置于 37°C過夜; 反應后的平板用剛果紅染色1h, 接著用0.85% NaCl脫色, 觀察是否出現水解圈,出現水解圈的即定為功能菌。每株菌做三個重復。

1.6 功能菌的鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠等, 2001)進行功能菌生物學特征觀察和生理生化試驗, 并結合16S rDNA序列分析方法進行鑒定。

1.6.1 生物學特征觀察 將功能菌接種至 SLB培養基的培養皿平板, 放入溫度設置為 37°C的恒溫箱中, 培養24 h, 觀察菌落形態特征。

1.6.2 生理生化試驗 進行功能菌部分生理生化試驗, 包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇的產酸試驗; 接觸酶、苯丙氨酸脫氨酶試驗、明膠、淀粉、酪氨酸水解試驗; V-P測定、吲哚產生試驗、利用檸檬酸鹽試驗。

1.6.3 16S rDNA序列分析 參照文獻(徐長安等,2011), 采用磁珠法基因組DNA抽提試劑盒提取功能菌全基因組。以全DNA為模板, 使用細菌16S rDNA通用引物, 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R: 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。用 Taq DNA聚合酶進行PCR擴增, PCR程序為: 94°C預變性 4min; 94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 1 min, 30 個循環;72°C 10 min 修復延伸; 4°C ∞終止反應。使用 SanPreP柱式 DNA膠回收試劑盒純化 PCR產物。純化后的PCR產物送至上海生工測序。將測得的16S rDNA序列輸入www.ncbi.nlm.nih.gov Blast進行同源性搜索,選取其中與之同源性較高的菌株, 用 MEGA軟件進行系統發育樹分析, 構建進化樹。

1.7 酶活特性分析

接種功能菌株至LB培養基中, 37°C, 180 r/min,活化6h, 活化好的菌液按10% 接種至產纖維素酶培養基, 37°C, 180 r/min, 發酵 24h 后, 10000 r/min, 離心6min, 棄去沉淀, 得上清液, 為粗酶液。參照文獻(韓銘等, 2012; 于嵐等, 2013), 采用3, 5-二硝基水楊酸比色定糖法(DNS)進行酶活測定, 分別考察功能菌株所產的纖維素酶對溫度、pH值和紫外線的耐受能力。

1.7.1 酶對pH值的耐受能力檢測 粗酶液在不同pH緩沖液(3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0)混合均勻, 置于37°C, 處理1h, 測定殘存酶活, 以最高酶活為100%。

1.7.2 酶對溫度的耐受能力檢測 粗酶液分別在溫度為 30、40、50、60、70、80°C的水浴鍋中處理1h后, 測定殘存酶活, 以最高酶活為100%。1.7.3 紫外線對酶活性的影響 粗酶液分別在紫外線波長365nm, 距離10cm下照射10、20、30、40、50、60 min后, 測定殘存酶活, 以最高酶活為100%。

1.8 拮抗性能檢測

1.8.1 抑菌板的制作 選擇嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌, 用接種環刮下菌體接種至裝有5mL LB培養基的試管中, 放入溫度設置為37°C, 轉速為180 r/min的搖床中培養16h后, 取1 mL的培養液至100 mL的45—50°C的 SLB培養基中, 迅速搖勻倒板, 待凝固后用打孔器打孔。

1.8.2 發酵上清的制備 功能菌FA08斜面接種至裝有5mL LB培養基的試管中, 放入溫度設置為37°C,轉速為180 r/min的搖床中活化6 h后, 按10%的接種量至裝有50 mL LB培養基的三角瓶中, 放入溫度設置為 37°C, 轉速為 180 r/min的搖床中發酵 17 h,10000 r/min 離心6 min, 得發酵上清。

1.8.3 采用瓊脂擴散法(agar diffusion method)進行測定(Tagget al, 1971)。通過測量圓形的透明帶(抑菌圈)直徑的大小來表示發酵上清液抑菌活性的強弱。

2 結果與分析

2.1 目標菌篩選結果

經實驗發現, 標識為 FA08的菌株, 三個重復均出現水解圈, 如圖1所示, 而其它菌株未出現水解圈,因此 FA08為目標功能菌。

圖1 功能菌FA08水解圈Fig.1 The hydrolysis circle of strain FA08

2.2 功能菌FA08生物學特征觀察

將功能菌FA08接種至SLB培養基的培養皿平板,37°C培養 24h, 發現菌落白色微黃, 中間凸起, 表面光滑, 邊緣不規則, 革蘭氏染色為陽性, 產芽孢。

2.3 生理生化試驗

功能菌FA08的部分生理生化實驗結果如表1所示。

表1 功能菌FA08的生理生化檢測結果Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain FA08

2.4 16S rDNA鑒定結果

16S rDNA測序結果顯示, 菌株 FA08的 16S rDNA序列全長為1407bp。全序列見圖2。將測得的序列輸入國際核酸數據庫(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov), 用Blast進行同源序列搜索, 在搜索結果中, 選出同源性較高的菌株系列(表2), 用MEGA 軟件進行系統發育分析, 并構建系統進化樹, 結果如圖3所示,通過比較可以明顯看出, FA08在遺傳位置上與Bacillus licheniformis(X68416)和Bacillus licheniformis(NR118959)兩株地衣芽孢桿菌最近, 且與Bacillus licheniformis(X68416)同源性最高達99%。結合其形態學及生理、生化特征, 鑒定功能菌 FA08為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis), 登錄號為KM892857。

2.5 酶學特性分析結果

2.5.1 pH值對 FA08所產生的纖維素酶穩定性的影響 如圖4所示, FA08所產纖維素酶在pH 4下穩定性最好, 且pH 3和pH 5—10下保持較好的穩定性,相對酶活保持在 85%以上, 因此該酶對酸堿的耐受能力較強。

2.5.2 溫度對FA08所產生的纖維素酶穩定性的影響如圖5所示, FA08所產纖維素酶在30—40°C保持較好的穩定性, 50—70°C相對酶活保持在 75%以上,80°C下相對酶活仍能保持在 70%以上, 因此該酶對溫度具有較好的耐受能力。

2.5.3 紫外線對FA08所產生的纖維素酶穩定性的影響 從圖6可以看出在紫外線照射的條件下FA08所產生的纖維素酶保持穩定性, 酶活均接近 100%,因此該纖維素酶對紫外線具有很強的耐受性。

圖2 功能菌FA08 16S rDNA 測序結果Fig.2 The 16S rDNA sequence of strain FA08

圖3 基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic dendrogram based on 16S rDNA sequence

表2 選自基因庫中用于構建系統發育樹的菌株及其錄入號Tab.2 The strains and the accession numbers in GenBank for phylogenetic dendrogram construction

圖4 pH值對FA08所產生的纖維素酶穩定性的影響Fig.4 The effect of pH on the stability of cellulase produced by strain FA08

圖5 溫度對FA08所產生的纖維素酶穩定性的影響Fig.5 The effect of temperature on the stability of cellulase produced by strain FA08

圖6 紫外線對FA08所產生的纖維素酶穩定性的影響Fig.6 The effect of UV on the stability of cellulase produced by strain FA08

2.6 功能菌FA08發酵上清對水產病原菌的拮抗性能

拮抗試驗結果表明: 如表 3所示, 功能菌 FA08對水產養殖常見致病菌: 嗜水氣單胞菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌均有較強的抑制作用, 其中對嗜水氣單胞菌抑制作用最強。

表3 功能菌FA08發酵上清對病原菌的拮抗性能Tab.3 Antimicrobial activity of FA08’s supernatant on selected pathogens

3 討論

地衣芽孢桿菌作為生防細菌廣泛應用于植物病害防治、飼料加工、醫藥開發、環境污染治理等方面(唐娟等, 2008)。1989年, 美國FDA和美國飼料控制官員協會公布了地衣芽孢桿菌是安全的微生物物種,可以直接飼用; 我國農業部也把地衣芽孢桿菌列入飼料添加劑目錄(馬鑫等, 2011), 允許在飼料中直接添加。另外, 地衣芽孢桿菌在水產養殖方面也有很好的應用價值, 如地衣芽孢桿菌作為魚飼料添加劑, 不僅可以促進魚體生長, 而且益于養殖水體的保護(葛文霞等, 2014); 地衣芽孢桿菌和低聚木糖, 可提高魚體中消化酶的活性, 有助于維持腸道內的微生態平衡, 促進動物生長(劉波等, 2006); 地衣芽孢桿菌增加了腸道消化酶活性, 促進了魚體生長(劉波等,2005)。另有研究表明, 地衣芽孢桿菌具有耐高溫、耐酸堿的特性, 并能產生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶等, 有助于降解植物性飼料中某些復雜的碳水化合物, 消除抗營養因子(董尚智等, 2009)。本實驗所篩選的功能菌 FA08鑒定為地衣芽孢桿菌, 且可產生纖維素酶, 預示著該菌具有較好的開發與應用前景。

通過考察地衣芽孢桿菌FA08產生的纖維素酶對酸堿穩定性的影響, 發現 FA08產生的纖維素酶對酸堿均能保持較好的穩定性, pH3和pH 5—10下相對酶活保持在 85%以上, 與楊麗娜等(2012)篩選到的芽孢桿菌屬(Bacillus)微生物所產的纖維素酶相比, 在酸性條件下的耐受能力強, 具有相似性, 而在中性、堿性條件下地衣芽孢桿菌FA08產生的纖維素酶更具耐受能力。水產動物大多數無胃, 消化道呈中性(鯉科魚類)或偏堿性(王仁華等, 2011), 因此地衣芽孢桿菌FA08產生的纖維素酶不僅適合于有胃的動物, 而且也適合應用于水產動物。另外, 地衣芽孢桿菌生長條件要求低, 繁殖快, 能迅速定植在腸黏膜上, 在短時間內成為腸道的優勢菌群(張菊等, 2012), 并在腸道中發揮作用, 有利于開發成為內服的微生物制劑。

實驗發現, 地衣芽孢桿菌FA08產生的纖維素酶對溫度有較好的耐受能力, 耐受 80°C下相對酶活仍能保持在 70%以上, 與葛春輝(2009)篩選到的蠟質芽孢桿菌所產的纖維素酶相比, 更具有耐溫特性。在飼料原料中, 雜粕類的原料粗纖維含量高, 存在抗營養因子, 大大限制了其在飼料中的使用量, 目前發酵技術的應用, 可提高雜粕類原料的使用價值, 降解雜粕原料中水產動物難以消化的纖維素, 消除抗營養因子, 提高雜粕原料的利用率。一般飼料原料的發酵溫度可達60—80°C, 而地衣芽孢桿菌FA08產生的纖維素酶可較好耐受發酵溫度, 可應用于雜粕的發酵, 提高雜粕的營養價值。

地衣芽孢桿菌對有害微生物具有拮抗作用: 如地衣芽孢桿菌 Wl0能產生抗菌蛋白, 對多種植物病原菌有較好的抑制效果(紀兆林等, 2013); 又如地衣芽孢桿菌 c-4具有較廣的抑菌范圍, 對番茄枯萎病菌、玉米彎孢葉斑病菌、膠孢炭疽病菌、棉花枯萎病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌和西瓜枯萎病菌等均有抑制作用(孫正祥等, 2009)。然而地衣芽孢桿菌對水產養殖病原菌的拮抗特性報道較少。本實驗也探討了地衣芽孢桿菌FA08發酵上清對水產常見病原菌的拮抗效果, 發現地衣芽孢桿菌FA08對水產病原菌:嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌均有較強的拮抗作用。由于地衣芽孢桿菌具有在水產動物腸道定植的特性,這意味著地衣芽孢桿菌 FA08進入水產動物腸道后,在腸道內可產生拮抗物質, 對病原菌進行抑制或殺滅作用, 促進水產動物腸道健康, 有著重要的意義,另外, 也可利用 FA08的拮抗性能, 制備微生物殺菌劑。

本研究開展了地衣芽孢桿菌FA08的篩選與鑒定,考察了該菌的酶學性質和抗菌特性, 初步評估該菌的開發與應用價值, 下一步將進行其作為養殖動物腸道定植菌、雜粕飼料發酵菌及制備微生物殺菌劑的研究與開發, 實現FA08在水產養殖中的應用價值。

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