不同濃度阿司匹林對成骨細胞增殖的影響

王昌超，成業東，黃亞東，高超，姜鵬，馮海波，王加波，黃妍

(1中國人民解放軍第82醫院，江蘇淮安223001;2江蘇食品藥品職業技術學院)

骨質疏松癥是中老年人的常見疾病之一，嚴重影響中老年人，特別是老年女性的健康和生活質量。目前，抗骨質疏松藥物種類較多，但在應用過程中多存在不良反應大、療程長、療效不佳等問題，患者治療依從性較差。有研究發現，低濃度阿司匹林服用一年以上能提高老年人的骨密度［1］，說明阿司匹林具有潛在的抗骨質疏松作用，但目前相關研究報道較少。2011～2014年，我們觀察了不同濃度阿司匹林對成骨細胞增殖和凋亡的影響，旨在為阿司匹林治療骨質疏松癥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人成骨細胞株(hFOBI.19)，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。主要試劑:阿司匹林(美國Sigma公司)，置于無菌注射用水溶解，加入NaOH滴定至pH 7.0，配制成濃度為100 mmol/L阿司匹林溶液;DMEM/F12培養基，美國Gibco公司;FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司;CCK-8試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 成骨細胞體外培養 成骨細胞復蘇后接種于底面積為75 cm2培養瓶中，加入10 mL DMEM/F12培養基和1 mL FBS，置于34℃、5%CO2培養箱中培養。24 h后細胞貼壁生長，每2～3天換液一次，第8～10天細胞長滿瓶底后傳代，取傳3～6代的成骨細胞用于實驗。

1.3 成骨細胞增殖活性檢測 采用CCK-8法。調整細胞密度至2×105個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。飽和濕度下，34℃、5%CO2培養箱中培養。細胞貼滿瓶底后，隨機分為阿司匹林低、中、高濃度組及對照組。阿司匹林低、中、高濃度組分別加入含終濃度為0.5、2、10 mmol/L阿司匹林的培養液［2］200 μL，對照組只加入培養液(含 10%FBS 的DMEM/F12培養基)200 μL，同時設空白對照組。每組設8個復孔。干預24 h，PBS洗滌3次，每孔按1∶9比例加入CCK-8溶液及培養液共100 μL，培養4 h，分光光度計檢測450 nm波長處吸光度值(OD值)，即代表成骨細胞的增殖活性。

1.4 成骨細胞凋亡檢測 調整細胞密度至2×105個/mL，接種于6孔板中，每孔2 mL。培養至細胞長滿培養瓶底，隨機分為阿司匹林低、中、高濃度組及對照組。阿司匹林低、中、高濃度組分別加入終濃度為 0.5、2、10 mmol/L 阿司匹林的培養液 2 mL，對照組不予處理。培養24 h收集細胞，加入400 μL Binding Buffer輕輕重懸細胞，加入AnnexinV-FITC 5 μL室溫避光孵育15 min，600 r/min離心沉淀5 min，將沉淀細胞用孵育緩沖液洗滌1次，加入10 μL PI染色液，冰浴避光放置10 min，流式細胞儀檢測成骨細胞凋亡率。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料以±s表示，結果比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組成骨細胞增殖活性比較 阿司匹林低、中、高濃度組 OD 值分別為 0.740 ±0.040、0.780 ±0.034、0.480 ±0.058，對照組為 0.620 ±0.031。阿司匹林低、中濃度組成骨細胞增殖活性明顯高于對照組、阿司匹林高濃度組(P均＜0.05)，阿司匹林高濃度組明顯低于對照組(P＜0.05)，而阿司匹林低、中濃度組差異比較無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 各組成骨細胞凋亡率比較 對照組成骨細胞凋亡率為10.35% ±0.39%，阿司匹林低、中、高濃度組分別為 8.30% ±0.35%、9.96% ±0.34%、11.3% ±0.35%。阿司匹林低、高濃度組與對照組比較差異有統計學意義(P均＜0.01)，阿司匹林中濃度組與對照組差異比較無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

成骨細胞是骨形成過程中的主要功能細胞，負責骨基質的合成、分泌和礦化。成骨的關鍵是成骨細胞處于功能活躍狀態。成骨細胞數量增加及功能增強均能發揮抗骨質疏松的作用。因此，抗成骨細胞凋亡或改進成骨細胞功能成為治療骨質疏松癥的有效方法［3］。

Yamaza等［4］研究證實，低濃度阿司匹林能改善去勢小鼠骨小梁和皮質骨密度;Wei等［5］進行的動物實驗進一步證實，阿司匹林具有促進成骨作用［5］。臨床研究也發現，長期口服阿司匹林能提高老年患者的骨密度［1］。但阿司匹林抗骨質疏松的作用機制尚未完全闡明［6］。有研究認為，阿司匹林可通過刺激骨形成途徑促進骨小梁的改建，改善骨小梁的三維結構，增加骨密度及力學強度［7］;通過COX-2酶、PGE2等參與成骨細胞合成［8］，促進成骨細胞增殖、成熟、礦化［9，10］。目前公認的抗骨質疏松經典通路為RANK-RANKL骨保護素和Wnt通路。阿司匹林影響Runx2表達，而Runx2刺激BMP2形成，通過 RANK-RANKL通路起抗骨質疏松作用［11，12］。阿司匹林可阻止 RANKL 誘導的骨質疏松，加速退化磷酸蛋白的降解，增加Wnt信號的水平，從而通過Wnt通路起抗骨質疏松作用［3］。Urganus等［13］認為，長期服用阿司匹林去勢小鼠RANKL減少和OPG增加。因此推測，阿司匹林可用于骨質疏松的治療。

本研究發現，阿司匹林低、中濃度組可促進成骨細胞增殖，阿司匹林低濃度組還能抑制成骨細胞凋亡，而阿司匹林中濃度組對成骨細胞凋亡無明顯影響;阿司匹林高濃度組可抑制成骨細胞增殖，促進成骨細胞凋亡。結果表明，低濃度阿司匹林能促進成骨細胞增殖，并抑制其凋亡，對骨質疏松治療有效。

綜上所述，低濃度阿司匹林能促進成骨細胞增殖、抑制其凋亡，有可能用于骨質疏松的預防及治療。此外，阿司匹林作為中老年人的常用藥，不良反應少、價格便宜，有更廣泛的應用前景。

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