非梗阻性無精子癥患者的外科取精方法應用進展

非梗阻性無精子癥患者的外科取精方法應用進展

崔險峰，丁攀，張云山

(天津市中心婦產科醫院，天津300100)

摘要：無精子癥可分為梗阻性無精子癥和非梗阻性無精子癥，后者所占比例較高。對非梗阻性無精子癥的治療不單純依賴于供精，通過外科取精技術獲得精子也越來越多的應用于臨床。常用的外科取精方法有常規睪丸切開活檢取精術、睪丸穿刺抽吸取精術、單一曲細精管活檢術、顯微切開睪丸取精術。近期對外科取精方法的研究主要集中于取精前對睪丸曲細精管生精功能的評價，評價技術有雙光子激光掃描顯微鏡、多光子顯微鏡、微型硅超聲探針技術。與外科取精獲精率相關的因素主要有Y染色體微缺失、睪丸病理類型。外科取精前對睪丸曲細精管生精功能作出評價有利于取精的成功。

關鍵詞：無精子癥；非梗阻性無精子癥；取精術；精子獲取技術

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.038

中圖分類號：R699文獻標志碼：A

收稿日期：(2015-06-26)

通信作者：張云山

無精子癥在一般男性人群中的發生率約為1%，而在存在不育問題的男性中約為10%。無精子癥可分為梗阻性無精子癥(OA)和非梗阻性無精子癥(NOA)，其中NOA約占60%[1]。對NOA的治療曾一度依賴于供精，患者不能擁有自己的遺傳學后代。1992年第1例應用卵泡漿內單精子注射(ICSI)技術進行輔助生殖獲得的胎兒成功分娩，之后睪丸外科取精技術被越來越多的應用于臨床。如何高效獲得數量足夠多、質量足夠高的活動精子成為NOA治療的關鍵?，F將NOA患者外科取精方法的應用進展情況綜述如下。

1外科取精方法

1.1常規睪丸切開活檢取精術(TESE)TESE是在局麻下切開陰囊皮膚長約2 cm，暴露睪丸白膜并切開約1 cm，輕輕擠壓睪丸，使睪丸組織由白膜切口處膨出，剪下適量睪丸組織(約5 mm×5 mm×5 mm)，放在精子培養液中，物理或消化酶處理后在顯微鏡下尋找精子。TESE可在睪丸一處或多處進行。常規TESE在NOA患者中的獲精率為40%左右[2]，多次TESE的獲精率較常規單次TESE的獲精率高。TESE操作簡單，能獲取足夠量的睪丸組織。TESE的缺點是創傷較大，損失睪丸組織較多，由于睪丸的動脈為終末動脈，一旦傷及較大血管有導致睪丸功能下降甚至萎縮的風險；TESE取精后6個月睪丸纖維化的發生率約為30%；TESE后NOA患者出現雄激素缺乏癥和性腺功能減退的風險明顯加大。TESE一般適用于附睪穿刺抽吸取精術(PESA)或睪丸穿刺抽吸取精術(TESA)取精失敗的OA患者及所有NOA患者。

1.2睪丸穿刺抽吸取精術(TESA)TESA一般是在局麻下施術，采用20 mL注射器配22 G針頭，避開睪丸皮膚上的血管，每側睪丸選6～9個點穿刺，抽吸獲得的睪丸組織液在200倍纖維鏡下尋找活動精子，獲得的精子可立即進行ICSI或冷凍保存。同時記錄每個穿刺點獲得精子的情況，以此繪制睪丸精子發生圖譜，以備本次體外受精失敗或冷凍精子解凍無存活而需再次睪丸取精時參考。這種經皮睪丸多點細針抽吸精子的方法由Turek等在1999年首先應用于NOA患者的睪丸取精。雖然TESA對睪丸的損失和引起的并發癥較TESE明顯減少，但大部分NOA患者睪丸中只是存在著局灶性的精子發生區，TESA很難精確地穿刺抽吸到這些存在精子發生的局灶性區域。因此，相比TESE而言，TESA的獲精率明顯下降，文獻[3，4]報道獲精率為10%～30%。Nowroozi等[5]的研究亦證實，對NOA患者而言，采用TESA的獲精率低于TESE。由于TESA的獲精率較低，這種取精方法現在更多用于以下情況：OA患者附睪取精失敗后的睪丸取精；前次TESA發現精子的NOA患者再次取精；病理檢查結果為生精功能低下的NOA患者的睪丸取精。

1.3單一曲細精管活檢術(SST)SST是縱向切開患者陰囊，將睪丸由切口處擠出，用26 G針頭在白膜無血管區刺透白膜，用顯微解剖鑷沿白膜上的針孔處進入睪丸，勾出一根曲細精管，在解剖顯微鏡下觀察。若曲細精管較粗、不透明、發白，則剪取該曲細精管，物理磨碎后鏡下尋找精子，若發現精子，則在該位置勾出更多的曲細精管，直到獲得足夠ICSI使用的精子；若發現勾出的曲細精管已纖維化，則另選一處，重復上述操作，直到發現精子或整個睪丸表面全部活檢過。由于單個曲細精管活檢取精操作不切開白膜，不會損傷血管，所以對睪丸的損傷較TESE小。但該操作對術者有一定的要求，術者需有能力在顯微鏡下鑒別出有可能存在精子發生的曲細精管。若采用該方法對睪丸深部組織進行活檢，則有發生睪丸內血腫的可能。Amer等[6]對264例NOA患者施行SST，采用安裝在目鏡上的千分尺測量曲細精管直徑，并將切下的曲細精管即刻處理后在倒置顯微鏡下尋找精子，結果顯示獲精率與曲細精管的直徑明顯相關：當曲細精管直徑>300 μm時獲精率可高達84.2%、>150 μm時獲精率49.2%、<150 μm時獲精率為31.4%；從一段直徑>300 μm的含精子曲細精管中所收獲的精子即可滿足臨床ICSI和精子冷凍的需要。

1.4顯微睪丸切開活檢取精術(Micro-TESE)有學者稱Micro-TESE為顯微外科睪丸切開取精術。這種技術的操作一般是在全麻或硬膜外阻滯麻醉下進行，在顯微鏡下(放大6～8倍)沿睪丸縱軸在白膜無血管區切開白膜，小心分離曲細精管，在解剖顯微鏡(放大16～25倍)下很容易區別曲細精管有無精子發生：可能存在精子發生者的曲細精管較粗、白色、不透明。發現這樣的曲細精管后將其剪斷，放在盛有精子培養液的培養皿中機械粉碎，置顯微鏡下(放大400倍)尋找精子。若在顯微鏡下找不到粗大的曲細精管，可在睪丸的不同部位隨機切取一些曲細精管，處理后在顯微鏡下尋找精子?，F有的研究[6]結果顯示，選取的生精小管直徑在110 μm時獲得的精子基本上可滿足臨床需要。與常規TESE比較，Micro-TESE在保證精子夠用的前提下，活檢的組織更少，獲精率更高，對睪丸的損傷更小[2]。Micro-TESE在NOA患者睪丸中的獲精率為35%～77%[7，8]，在染色體異常的NOA患者中的獲精率為42%左右[9]，在克氏征患者中的獲精率為60%左右[10]。Micro-TESE的優點顯而易見，但需要較熟練的外科微創操作技術。

2睪丸曲細精管生精功能的評價技術

總的來說，從NOA患者的睪丸中提取精子還是困難的，以目前的外科取精技術，在NOA患者睪丸中的獲精率為30%～50%。鑒于睪丸的組織學表現與NOA患者睪丸外科取精結果之間的相關性，一些研究者將研究的重點放在了外科取精前對睪丸曲細精管生精功能的評價上。

2.1雙光子激光掃描顯微鏡(TPLSM)技術TPLSM技術是一種以自體熒光為基礎，在不對觀察組織進行任何組織學處理(固定或染色)的情況下，對活組織進行細胞水平觀察的顯微技術。最近Achard等[11]采用TPLSM技術在小鼠活體上透過小鼠睪丸白膜(不切開白膜)成功測量了曲細精管直徑，同時切取對側睪丸組織，處理后于顯微鏡下測量曲細精管直徑，結果顯示兩種方法的測量數據差異無統計學意義。這一研究結果初步說明，采用TPLSM可以在不切開睪丸白膜的情況下，不需要任何預先處理即可通過測量曲細精管直徑而發現睪丸中的局灶性精子發生區。

2.2多光子顯微鏡(MPM)技術Ramasamy等[12]采用MPM技術分別研究了雄性大鼠在剛出生、性成熟前及性成熟后睪丸精子的發生情況，同時也研究了不同病理模型大鼠曲細精管的精子發生情況，結果顯示，有精子發生和無精子發生的曲細精管自發熒光的波長不同，這提示可根據自發熒光波長鑒別睪丸曲細精管是否有精子發生。這一研究為將來臨床上采用MPM技術在NOA患者睪丸的顯微外科取精過程中無創、實時觀測成為可能。

2.3微型硅超聲探針技術有研究者[13]在雄性大鼠睪丸組織中注入一種微型硅超聲探針，通過外部的測量儀器收集信號并處理后，可在體外對大鼠睪丸曲細精管的直徑進行準確測量，從而預先判斷哪些曲細精管可能有精子發生。這一研究結果為在采用Micro-TESE取精前，對睪丸內存在的局灶性精子發生點的準確定位提供了可能。

3與獲精率相關的因素

研究[14]發現，睪丸體積的大小[11]和清血卵泡刺激素、抑制素B、睪酮水平的高低均不能準確預測睪丸取精的結果。前次睪丸活檢發現活動精子，雖然不能保證隨后的睪丸活檢就一定能再發現精子，但再次發現精子的概率較高[3]。Y染色體微缺失、睪丸病理類型與外科取精獲精率的關系已成為研究的重點內容之一。

3.1Y染色體微缺失與外科取精獲精率的關系Y染色體微缺失與外科取精獲精率的關系已成為目前研究的重點內容之一。已有的資料[15]顯示，Y染色體存在AZFa區或AZFb區缺失的NOA患者沒有發現精子。目前有一種共識，對同時合并有Y染色體AZFa區或AZFb區缺失的NOA患者已不再推薦行任何形式的睪丸取精。但對于合并Y染色體AZFc區缺失的患者，從其睪丸中取到精子的概率還是比較高的。

3.2睪丸病理類型與外科取精獲精率的關系雖然睪丸活檢病理檢查結果不能準確預測外科取精結果，但目前仍被認為是最有價值的預測指標[16]。Colpi等[17]通過顯微切開睪丸取精法，在病理診斷分別為生精功能低下、生精成熟阻滯和唯支持細胞綜合征的三組NOA患者中，獲精率分別為91%、86%和25%。Abdel-Raheem等[18]的研究也支持睪丸活檢病理類型對NOA患者的TESE或Mic-TESE的取精結果有很好的預測價值，他們還建議在睪丸取精時同時做活檢病理檢查。丁攀等[19]對1997～2011年國內外公開發表的關于NOA患者外科取精的文獻進行了Meta分析，結果顯示，對NOA患者的睪丸進行外科取精，獲精率最高的方法是Micro-TESE(51.9%)，獲精率與睪丸病理類型密切相關，精子發生功能低下、精子成熟阻滯和唯支持細胞綜合征患者的獲精率分別為81.5%、48.8%和30.6%。

總之，對NOA患者的睪丸取精，總的原則是在保證能獲得足夠治療用的精子量的前提下，先微創后有創，先簡單后復雜。附睪穿刺不能用于NOA患者的外科取精，現在TESA技術也很少用于NOA患者的取精。目前常推薦的方法是TESE技術和Micro-TESE技術。但也有一些學者建議，對NOA患者的外科取精可先用TESA技術，若失敗再用TESE技術或Micro-TESE技術。外科取精前對睪丸曲細精管生精功能作出評價有利于取精的成功。

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