中國部分鴿mtDNA D—loop區遺傳多態性與系統進化分析

付勝勇+劉宏祥+謝鵬+童海兵+徐善金+陳衛彬+卜柱

摘要：利用PCR測序及生物信息學分析技術，測定中國境內8個品種（系）鴿108份樣本mtDNA D-loop區部分序列，研究中國部分肉鴿品種（系）的遺傳多態性與系統進化關系。結果表明，在擴增的761 bp mtDNA D-loop區序列間發現3個變異位點，約占分析位點總數的0.39，具4個單倍型;8個群體內單倍型多樣度為0.333～0.867，總體單倍型變異度為0.559，總體核苷酸多樣度為0.000 85，表現出較為貧瘠的遺傳多態性，未表現出顯著的遺傳分化;石岐鴿與歐洲肉鴿Ⅰ、銀羽王鴿與歐洲肉鴿Ⅰ、泰深鴿與銀羽王鴿間呈現出較大的遺傳距離，在后期配套系培育及雜交優勢利用方面具較大遺傳選育空間。

關鍵詞：鴿;mtDNA D-loop;遺傳多態性;系統進化

中圖分類號： S836.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0041-03

收稿日期：2014-05-16

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（12）3073];江蘇省揚州市農業科技攻關（編號：yz2011068）;江蘇省蘇北科技發展計劃（編號：BN2013043）。

作者簡介：付勝勇（1985—），男，四川內江人，碩士，助理研究員，從事家禽營養與品種選育研究。E-mail：xnfsy@163.com。

通信作者：卜 柱，碩士，副研究員，從事肉鴿生產與裝備創新研究。E-mail：jsbuzhu@163.com。

高等動物的線粒體DNA（mtDNA）為共價閉合的環狀雙鏈DNA分子，大小為16 355～16 359 bp，其結構簡單穩定，由37個基因和1段D-loop區（控制區）組成，符合母系遺傳，不受引進品種雜交改良的影響，可以真實地反映當地物種起源[1]。哺乳動物及鳥類在mtDNA中進化速度最快、多態性最豐富，在動物起源演化、遺傳距離測算生物地理學、系統發育等方面得到廣泛的應用[2]。從已公布的序列來看，鴿線粒體DNA由17 229對堿基構成[3]，分布有13個基因位點，其中，第15 573～17 229 bp序列為D-loop區，全長1 656 bp。本研究對中國鴿mtDNA D-loop區多態性及系統進化進行取樣分析研究，以推進我國肉鴿的系統選育工作。

1 材料與方法

1.1 材料

石岐鴿和銀羽王鴿血樣各12份，采自廣東省中山市石岐鴿場;2002年引自法國的歐洲肉鴿Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ系血樣各12份、源自美國的白羽王鴿和銀羽王鴿血樣各12份、源自深圳天翔達祖代種鴿場的卡奴鴿和泰深鴿血樣各12份，均采自江蘇省江陰威特凱鴿業有限公司。每群體取成年公鴿和母鴿各6羽，共計8個品種（系）108份樣本，采用檸檬酸+檸檬酸鈉+葡萄糖（ACD）抗凝靜脈采血1 mL，加入裂解液，4 ℃保存;采用Guo等的方法[4]提取基因組DNA。

1.2 引物設計

從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_013978）下載鴿子線粒體全序列（登錄號：NC_013978.1）為參考序列，用Primer 5.0軟件設計2對引物，擴增片段覆蓋D-loop區。引物信息為：F1：5′-TTCCGCTTGGCCTTTCTC-3′，R1：5′-GATGACCGCAATGCCGAA-3′;F2：5′-CTCGACCTCAGGTACTACTGGCGT-3′，R2：5′-ACTTCTGCGGTTCTGCCGGGATGT-3′。

1.3 線粒體DNA D-loop區擴增與序列測定

PCR擴增體系的反應程序：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火60 s，72 ℃延伸30 s，38個循環;72 ℃充分延伸 7 min，4 ℃保存。PCR產物用2.0%瓊脂糖（美國FMC）凝膠電泳檢測其片段大小、純度、亮度，小量膠回收試劑盒回收目的片段;分別取2.5～5.0 μL回收產物，用PCR引物進行測序反應，測序試劑采用Thermo Sequenase Cycle Squencing Kit（美國USB公司），按照操作規程進行;委托上海英俊生物測序公司使用LI-COR 4200 DNA自動分析儀（LI-COR Biotechnology Division，Lincoln，NE）進行序列分析。

1.4 數據處理

擴增所得的mtDNA D-loop區序列用DNA MAN進行序列編輯;用Mega軟件進行同源序列比對，DNA SP5.10軟件統計不同鴿品種（系）mtDNA D-loop區的核苷酸多態性位點數（number of polymorphie sites）、總突變位點數（total number of mutations）、單倍型數（number of Haplotypes）、單倍型多樣度（haplotype diversity）、核苷酸多樣性（nueleotide diversity）、平均核苷酸差異（average number of nucleotide differences）、遺傳距離等;采用鄰接法（Neighbor-Jointing，NJ）最大似然法、最大簡約法構建分子系統發育樹，其中節點自舉置信水平采用Bootstrap估計和1 000次循環;用Network軟件分析單倍型演變及分布情況。

2 結果與分析

2.1 不同鴿品種（系）mtDNA D-loop區單倍型與核苷酸變異

本研究擴增并測定肉鴿部分的D-loop 序列，靠近tRNAPro基因一側擴增片段總長為761 bp。由表1可見，8個群體單倍型多樣度為0.333～0.867，總體單倍型變異度為0559，總體核苷酸多樣度為0.000 850;利用Mega分析軟件對108條mtRNA D-loop區進行同源序列比對，在8個鴿品種（系）中共發現3個多態位點，分別位于第50、第51、第148堿基處;mtRNA D-loop區序列段由4種單倍體型組成。由圖1和表2可見，單倍型分布頻率以CTC型所占比例最大，為 62.96%，單倍型總數和多態位點總數以中山石歧鴿和歐洲肉鴿Ⅲ最豐富，涵蓋有全部多態性位點和單倍型。

表1 不同鴿品種（系）mtDNA D-loop 區單倍型與核苷酸變異

品種（系） 樣本數（份） 多態位點數（個） 單倍型數 單倍型多樣度 核酸多樣度

石岐鴿 12 3（50 bp，51 bp，148 bp） 4 0.525 0.000 770

銀羽王鴿 24 2（50 bp，51 bp） 3 0.386 0.000 530

歐洲肉鴿Ⅰ 12 1（148 bp） 2 0.667 0.000 880

歐洲肉鴿Ⅱ 12 1（51 bp） 2 0.500 0.000 660

歐洲肉鴿Ⅲ 12 3（50 bp，51 bp，148 bp） 4 0.867 0.000 158

卡奴鴿 12 2（50 bp，148 bp） 3 0.733 0.000 114

白羽王鴿 12 1（148 bp） 2 0.333 0.000 440

泰深鴿 12 1（148 bp） 2 0.533 0.000 700

總和 108 3 4 0.559 0.000 850

2.2 不同鴿品（系）種mtDNA D-loop 區序列系統發育進化樹構建

由圖2可見，本研究的鴿品種（系）mtDNA D-loop序列

表2 不同鴿品種（系）mtDNA D-loop 區單倍型分布頻率

名稱 單倍型 樣本數（份） 頻率（%）

H_1 CTT 19 17.59

H_2 CTC 68 62.96

H_3 CCC 7 6.48

H_4 TTC 14 12.96

大致聚為2個聚類簇，歐洲肉鴿Ⅰ、Ⅲ和泰深鴿可分為一大類，卡奴鴿、石岐鴿、銀羽王鴿、白羽王鴿等品種（系）可分為另一大類，在系統進化上顯現出品種（系）間的血緣關系遠近和親疏訊息。

2.3 不同鴿品種（系）間遺傳距離

由表3可見，我國現存不同鴿品種（系）間遺傳距離變異范圍為0.000 7～0.005 1;石岐鴿與歐洲肉鴿Ⅰ、銀羽王鴿與歐洲肉鴿Ⅰ、泰深鴿與銀羽王鴿間距離值較大，分別為 0.004 7、0.005 1、0.004 4;其他品種（系）間距離值相對較小，變異范圍為0.000 7～0.004 1。

表3 不同鴿品種（系）間kimura雙參數遺傳距離

品種（系）

遺傳距離

SQ YY OⅠ OⅡ OⅢ KN TS BY

SQ — 0.001 6 0.004 7 0.002 0 0.003 4 0.002 3 0.004 1 0.002 3

YY 0.001 6 — 0.005 1 0.001 8 0.003 4 0.002 2 0.004 4 0.002 2

OⅠ 0.004 7 0.005 1 — 0.003 3 0.002 9 0.002 9 0.000 7 0.002 9

OⅡ 0.002 0 0.001 8 0.003 3 — 0.002 9 0.001 8 0.002 9 0.001 8

OⅢ 0.003 4 0.003 4 0.002 9 0.002 9 — 0.002 9 0.002 9 0.002 9

KN 0.002 3 0.002 2 0.002 9 0.001 8 0.002 9 — 0.002 7 0.001 9

TS 0.004 1 0.004 4 0.000 7 0.002 9 0.002 9 0.002 7 — 0.002 7

BY 0.002 3 0.002 2 0.002 9 0.001 8 0.002 9 0.0019 0.002 7 —

注：SQ、YY、OⅠ、OⅡ、OⅢ、KN、TS、BY分別為石岐鴿、銀羽王鴿、歐洲肉鴿Ⅰ、歐洲肉鴿Ⅱ、歐洲肉鴿Ⅲ、卡奴鴿、泰深鴿、白羽王鴿。

3 結論與討論

本試驗測定了8個鴿品種（系）間共108個mtDNA D-loop序列，發現有3個變異位點，分別位于第50、第51、第148堿基，占分析總數的0.39%，所有多態位點均為兩核苷酸變異;8個鴿品種（系）間檢測到4種單倍型，單倍型多樣度為0.559，核苷酸多樣度為0.000 850，多樣性相對較為匱乏，這與胡永勝等研究結論[5]不一致，可能是因為選擇的序列區域與比對范圍不同。相對于驢、牦牛、奶山羊、雞等家畜禽[2，6-7]動輒成十上百的變異位點而言，我國現有鴿品種（系）顯現出較為不豐富的遺傳多態性，這可能與鴿專門化品系選育工作開展較晚及鳥類特有的飛翔遷移流動性較大有關。品種（系）選育導致品種間有差異變化的基因突變不能有效留存下來;鳥類特有的飛翔遷移流動性導致群體間不能形成有效的環境、氣候、生態樣生殖隔離，進而閉鎖繁衍出新的類群或亞型，引起自然地域隔離造成生態多樣性減少[8]。系統進化分析結果表明，本研究中的鴿種群均可追溯于同一母系起源，我國現存鴿品種（系）大致分為2類，從歐洲引進的歐洲肉鴿和泰深鴿為1類，從美國引進的白羽王鴿、銀羽王鴿及地方品種石岐鴿等為另一大類。

石岐鴿是由廣州中山海外僑胞帶回的優良種鴿與中山本地優良鴿品種進行雜交培育而成[8]，距今已有100年歷史。本試驗結果表明，石岐鴿與銀羽王鴿間遺傳距離較小，為0001 6，在系統發育進化樹中也與銀羽王鴿同支相連，這說明在石岐鴿品種形成過程中，可能引入了銀羽王鴿血統?？ㄅ澰诿绹貦傍潏?915年開始選育，1932年正式命名，先后導入卡奴鴿與白色賀姆鴿、白羽王鴿和白色侖替鴿等血脈[9]，卡奴鴿與其他各品種（系）間遺傳距離差異較小，主要與其育成過程有關。

泰深鴿、歐洲肉鴿屬于歐洲地域品種，而白羽王鴿、卡奴鴿、銀羽王鴿屬于北美地域品種，國內的石岐鴿兼有北美血統和亞洲血統[9]，本研究中遺傳距離參數測算分析的結果與之較為吻合，即相同區域內的鴿品種（系）間遺傳距離較近，不同區域間鴿品種遺傳距離較遠。遺傳距離測算分析表明，石岐鴿與歐洲肉鴿Ⅰ、銀羽王鴿與歐洲肉鴿Ⅰ、泰深鴿與銀羽王鴿間遺傳距離較遠，在后期雜交優勢利用、配套系培育方面有較大的遺傳選育空間。

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