IBA濃度與培養基對黃芩不定根生物量和總黃酮含量的影響

田海麗+全雪麗+秦嘉澤+吳松權

摘要：為了篩選適宜黃芩不定根生長的培養基和IBA濃度，研究了2種培養基B5、MS以及不同濃度IBA對不定根生長和總黃酮積累的影響。結果表明，B5+1.0 mg/L IBA為最適培養基，此時黃芩不定根生長狀態良好、健壯，生物量較多，并且總黃酮含量最高，達到2.49 mg/g，明顯高于其他處理。

關鍵詞：黃芩;不定根;IBA濃度;培養基;總黃酮

中圖分類號：S567.23+9.043 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2015）04-0065-02

收稿日期：2014-05-23

基金項目：吉林省科技項目（編號：201115228）。

作者簡介：田海麗（1990—），女，陜西寶雞人，碩士研究生，主要從事植物生物技術研究。E-mail：tianhaili123@sina.com。

通信作者：吳松權，博士，副教授，碩士生導師，主要從事植物種質研究。Tel：（0433）2435633;E-mail：arswsq@ybu.edu.cn。

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）為唇形科黃芩屬多年生草本植物，別稱山茶根、黃金茶，始載于《神農本草經》，被列為中品[1]。黃芩以根入藥，其味苦性寒，有清熱除濕、瀉火解毒、止血安胎、鎮靜抗炎的功效[2-3]。黃酮類化合物是黃芩的有效成分，具有較強的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗HIV、清除自由基等作用，并且其毒性小，不易產生耐藥性，生物安全性高[4-8]。這些特點使得黃芩的應用和開發越來越受到國內外醫學界的關注，需求量隨之急劇增加，致使野生黃芩被大量采挖，野生資源遭到了嚴重破壞，而黃芩在栽培過程中往往出現品質下降、農藥殘留等問題，市場供求矛盾日益尖銳。

不定根培養是一種植物器官培養方法，近年來正成為獲取特定次生代謝產物的有效手段之一，具有生長周期短、可人為控制生長條件、重復性強等優點[9]。在目前的藥用植物不定根研究中，研究得較為透徹的是人參，如韓國在研究人參不定根培養方面取得了重大成就，已達到了工業化生產程度;我國科研人員也相繼對丹參、太子參、三七、紅豆杉、甘草、柴胡、蒼術、白術、東北刺人參、黃芪進行了研究[10]。但是目前還未發現利用黃芩不定根進行次生代謝的研究，因此本試驗以黃芩為材料誘導不定根，研究B5、MS培養基與不同IBA濃度的組合對不定根增殖的影響，以期通過測定生物量、總黃酮含量，優化出最適宜的培養基與IBA激素濃度，為利用黃芩不定根規?；a黃酮類化合物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

黃芩種子采集于吉林省延邊朝鮮族自治州安圖縣。標準品蕓香苷購自上海融禾醫藥科技發展有限公司;試驗中所用到的其他試劑均為分析純。

主要儀器為UV-3100紫外-可見分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃芩不定根誘導 選取籽粒飽滿的黃芩種子播種，待苗長至6 cm時，選取根部，先用自來水沖洗2 h，再分別用75%乙醇漂洗45 s、無菌水漂洗3次、0.1%氯化汞消毒 6 min、無菌水漂洗6次后切成1 cm×1 cm的外植體，接種于B5+2.0 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂、pH值為5.8的培養基上，于（25±1） ℃暗培養，誘導不定根。

1.2.2 培養基及激素濃度組合的篩選 培養基為MS、B5，添加不同濃度的IBA（0、1、2、3、4、5 mg/L），培養基中其他成分同誘導培養基。在（25±1） ℃條件下暗培養7周，60 ℃烘干后稱其干質量，即為生物量。

1.2.3 總黃酮測定 （1）對照品溶液的制備：精確稱取1 mg蕓香苷標準品，置于10 mL容量瓶中，先加30%乙醇溶解，再定容至10 mL，混勻后配制成標準溶液。（2）標準曲線的繪制：精確量取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL對照品溶液，分別置于10 mL容量瓶中，加30%乙醇至5 mL，再分別加入 0.3 mL 5%亞硝酸鈉，混勻，靜置6 min;加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻，靜置6 min;加入2.0 mL 1 mol/L的氫氧化鈉溶液，再分別用30%乙醇定容至10 mL，靜置15 min，在 510 nm 波長處測定其吸光度D510 nm。以吸光度D510 nm為縱坐標、標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線，y=11.892 9x+0077 6，r2=0998 2。（3）樣品溶液制備：稱取100 mg烘干至恒質量的黃芩不定根，在液氮中充分研磨，加入1 mL無水乙醇充分混勻，振蕩暗提取24 h，12 000 r/min離心10 min，收集上清液置于1 mL容量瓶備用。（4）樣品總黃酮的測定：精確量取 0.3 mL 樣品，以取樣0 mL為空白對照，按照標準曲線的制備步驟的“加入30%乙醇至5 mL”起，至“分別測其吸光度”，從標準曲線上讀出樣品溶液中總黃酮的含量。

1.2.4 統計分析 使用SPSS 19.0進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 培養基與IBA濃度對不定根生長的影響

由表1可以看出，在B5、MS培養基中，不定根的生長能力不同，且2種培養基之間存在顯著性差異，B5培養基顯著優于MS培養基，不定根在B5培養基中生長旺盛、分化多、白嫩、生長狀態良好、老化速度慢，而在MS培養基中不定根生長緩慢、分化少、易老化，且生物量少。從激素濃度看，IBA促進了黃芩不定根生長，B5培養基與IBA組合促進了黃芩不定根的生物量積累，顯著高于MS培養基與IBA組合;并且隨著IBA濃度的提高，不定根上的愈傷組織也隨之增多，當IBA濃度為1.0 mg/L時，不定根生長旺盛、分化多、根長、基本無愈傷組織，生物量較大，達0.628 g;當IBA濃度為4.0 mg/L時，生物量積累最大達0.641 g，但是此時不定根分化較少，且根長度較短，愈傷組織較多;當IBA濃度為5.0 mg/L時，生物量有所減少，這可能與激素濃度過高有關。

表1 培養基與IBA濃度對黃芩不定根生物量的影響

培養基

類型

不同IBA濃度的不定根生物量（g）

0 mg/L 1.0 mg/L 2.0 mg/L 3.0 mg/L 4.0 mg/L 5.0 mg/L

B5 0.168j 0.628b 0.526d 0.612c 0.641a 0.436e

MS 0.128k 0.284g 0.242h 0.176i 0.304f 0.244h

注：表中數據后標有不同小寫字母代表在0.05水平下差異顯著。表2同。

2.2 培養基與IBA濃度對黃芩培養基不定根總黃酮含量的影響

由表2可以看出，IBA對黃芩不定根總黃酮的累積有促進作用，添加IBA后不定根的總黃酮量明顯高于對照組，雖然MS培養基與IBA組合對總黃酮含量促進作用明顯高于B5培養基與IBA組合，但是B5培養基中不定根的生物量顯著高于MS培養基（表1），因此認為B5培養基更利于總黃酮的累積。IBA濃度為1.0 mg/L時，總黃酮含量最高，且與其他處理之間存在顯著性差異;當IBA濃度為3.0 mg/L時，B5培養基總黃酮含量與對照無顯著性差異，而MS培養基與對照之間存在顯著性差異。因此可以認為，選擇適當的IBA濃度才能增加黃芩不定根總黃酮的含量;萬貴香等研究也表明，適宜的外源激素才能促進黃芩愈傷組織中黃芩苷的積累[11]。

表2 培養基和IBA濃度對黃芩不定根總黃酮含量的影響

培養基

類型

不同IBA濃度的總黃酮含量（mg/g）

0 mg/L 1.0 mg/L 2.0 mg/L 3.0 mg/L 4.0 mg/L 5.0 mg/L

B5 1.54bcd 2.49a 1.54bcd 1.34cd 2.11ab 1.79abcd

MS 0.59e 2.03abc 1.57bcd 1.39bcd 1.06de 1.97abc

注同表1。

3 結論

由研究結果可以看出，無論是B5還是MS培養基，在供試IBA濃度范圍內黃芩不定根生物量與總黃酮的累積都存在2個高峰。第1個高峰期為1.0 mg/L IBA，這可能是低濃度的IBA促進了不定根的生長與黃酮類物質的積累;隨著IBA濃度增加，對其促進作用減小并逐漸形成激素脅迫使生物量與總黃酮減少;之后隨著IBA濃度進一步增加，不定根響應激素脅迫而逐漸適應了較高的IBA濃度，出現了第2個高峰期，在B5培養基生物量和總黃酮最高時期為4.0 mg/L處理，而MS培養基中生物量最高時期為4.0 mg/L處理，總黃酮最高時期為5.0 mg/L處理?？梢婞S芩不定根在不同培養基中應對高濃度外源激素脅迫的能力是有不同的，總體可見，B5培養基中IBA濃度為1.0 mg/L時，總黃酮含量最高，達2.49 mg/g。

B5培養基和MS培養基主要區別在于培養基的銨態氮與硝態氮比值的差異，B5培養基銨態氮與硝態氮比值是MS培養基的1/6，銨態氮含量遠低于MS培養基，從而使硝態氮更利于不定根生長及總黃酮積累，這也可能是B5培養基優于MS培養基的原因。Cui等研究發現，氮源類型影響不定根生長及次生代謝產物積累，硝態氮更利于不定根的生長[12]。本試驗表明，黃芩不定根在B5培養基中生長狀態良好，而且B5培養基生物量顯著高于MS培養基，使B5培養基總黃酮積累顯著高于MS培養基，推測是由于氮源類型的差異引起的，這還需要進一步的試驗鑒定。

參考文獻：

[1]周錫欽，張慶英，梁 鴻，等. 黃芩中主要黃酮類成分的含量分析[J]. 中國中藥雜志，2009，34（22）：2910-2915.

[2]張 瑜，武 斌. 黃芩藥理作用的研究進展[J]. 醫學綜述，2013，19（6）：1091-1093.

[3]王 瑋，白 月，王俊平. 黃芩莖葉總黃酮對大鼠氣囊滑膜炎抗炎作用機制的研究[J]. 沈陽醫學院學報，2008，10（1）：24-25.

[4]趙 梅，周淑琴. 黃芩中黃酮類化合物抗腫瘤作用的研究進展[J]. 中國藥房，2013，24（11）：1050-1052.

[5]Li-Weber M. New therapeutic aspects of flavones：the anticancer properties of Scutellaria and its main active constituents Wogonin，Baicalein and Baicalin[J]. Cancer Treatment Reviews，2009，35（1）：57-68.

[6]Zhang D Y，Wu J，Ye F，et al. Inhibition of cancer cell proliferation and prostaglandin E-2 synthesis by Scutellaria baicalensis[J]. Cancer Research，2003，63（14）：4037-4043.

[7]郭少英，程發峰，鐘相根，等. 黃芩苷的體外抗氧化研究[J]. 時珍國醫國藥，2011，22（1）：9-11.

[8]李晨睿，牛銀波，潘亞磊，等. 黃芩藥動學研究進展[J]. 中國藥理學通報，2013，19（8）：1048-1053.

[9]Wu S Q，Lian M L，Gao R，et al. Bioreactor application on adventitious root culture of Astragalus membranaceus[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2011，47（6）：719-724.

[10]尹雙雙，高文遠，王 娟，等. 藥用植物不定根培養的影響因素[J]. 中國中藥雜志，2012，37（24）：3691-3694.

[11]萬貴香，馬 琳，張 堅. 不同濃度的外源激素對黃芩愈傷組織的生物量和黃芩苷含量的影響[J]. 中國中藥雜志，2012，37（24）：3799-3802.

[12]Cui X H，Murthy H N，Wu C H，et al. Adventitious root suspension cultures of Hypericum perforatum：effect of nitrogen source on production of biomass and secondary metabolites[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2010，46（5）：437-444.