淡黃花百合花粉活力及其測定方法比較

劉偉+丁長春+沐建華

摘要：用I-KI法、氯化三苯基四氮唑（TTC）法、離體萌發法連續7 d對淡黃花百合（Lilium sulphureum Baker）的花粉活力進行測定，結果表明，I-KI法、離體萌發法、TTC法測定的淡黃花百合花粉活力不完全相同。I-KI法、離體萌發法所得花粉活力無顯著差異。I-KI法、離體萌發法所得花粉活力無顯著差異，由于I-KI法較離體萌發法簡單、成本低、所需時間短，因此是快速測定淡黃花百合花粉活力的最佳方法。開花第2至第4天花粉活力最高且無顯著差異，這幾天都可以進行雜交授粉，但從發育的角度考慮，以開花第2天授粉最佳。

關鍵詞：淡黃花百合;花粉活力;離體萌發法;TTC法;I-KI法

中圖分類號： S682.2+65.03 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0198-02

收稿日期：2014-06-03

基金項目：云南省教育廳自然科學研究項目（編號：2013Y582）;文山學院重點學科資助項目（編號：09wsxk 02）。

作者簡介：劉 偉（1977—），男，湖南祁東人，碩士，講師，從事植物學研究。E-mail：liuwei00780@126.com。

百合是世界五大切花之一，也是國內重要的高檔花卉。我國野生百合種質資源豐富，為培育百合新品種奠定了良好的種質資源基礎[1]?；ǚ凼情_展雜交育種最基本也是最重要的材料，花粉活力大小對育種效果影響很大，授粉前對花粉活力進行檢測至關重要[2]。許多學者對不同植物的花粉活力測定方法進行研究，常用的方法包括染色法、萌發法[3-7]。郝瑞娟等比較了亞洲百合、東方百合、麝香百合的部分栽培品種花粉活力的測定方法，認為染色法簡單，萌發法準確，育種時應將二者結合使用[8]。趙興華等對百合花粉生活力測定、貯藏方法進行了研究[9]。張福平等研究了影響百合花粉活力的化學因素[10]。車代弟等對東方百合花粉萌發培養基組分進行了優化[11]。尹恒等研究了麝香百合花粉發芽適宜培養基及最佳貯藏條件，認為蔗糖濃度、硼酸濃度等對花粉萌發均有較大影響[12]。本研究以淡黃花百合花粉作為材料，用萌發法、染色法對淡黃花百合的花粉活力進行測定，目的在于獲取快速測定花粉活力的最佳方法，明確淡黃花百合花粉活力最高時期，在此基礎上確定雜交育種最佳授粉時間，旨在為提高淡黃花百合育種效率提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

將從野外采集和云南省文山市中藥材市場購買的淡黃花百合種球種植于文山學院生物園地，待其快綻放時，收集不同時期的新鮮百合花粉。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 每天早晨觀察百合花蕾期，待其開花前 1 d 09：00左右開始采集花粉，將花蕾輕輕剝開，用刀片切取 1/2 個花藥，用錫箔紙包裹，置于保鮮袋中，迅速帶回實驗室進行試驗。每天在同一時間采集花粉并進行試驗。所采集的花粉均來自生長健壯、無病蟲害的同一植株，測量期間按時澆水，確保水分充足。

1.2.2 花粉活力測定

1.2.2.1 I-KI染色測定法[13] 取2 g KI溶于10 mL蒸餾水中，加入1 g I2待其全部溶解后，再加蒸餾水至200 mL，配好試劑后，貯于棕色瓶中備用。用解剖針挑取少量花粉置于載玻片上，加入1～2滴I2-KI溶液，輕輕蓋上蓋玻片放置1～2 min，置于低倍顯微鏡下觀察。凡染成藍紫色的為發育好、活力強的花粉，呈黃褐色的為發育不良的花粉。每處理3個玻片，每個玻片觀察5個視野，計算平均值?；ǚ刍盍τ嬎愎饺缦拢?/p>

花粉活力= （藍色花粉粒數/總花粉粒數）×100%。

1.2.2.2 氯化三苯基四氮唑（TTC）染色測定法[13] 用解剖針取少量花粉置于載玻片上，加1～2滴0.5% TTC溶液，蓋上蓋玻片。將裝片置于35 ℃恒溫箱中，15 min 后置于低倍顯微鏡下觀察，染成紅色的為生活力強的花粉，淡紅色的次之，無色者為沒有活力或不育的花粉。每處理3個玻片，每個玻片觀察5個視野，計算平均值?；ǚ刍盍τ嬎愎剑夯ǚ刍盍?（被染色的花粉粒數/總花粉粒數）×100%。

1.2.2.3 離體萌發法[13] 配制0.01%硼酸、0.03% CaCl2、0.35 mol/L蔗糖、0.7%瓊脂的固體培養基，將配好的培養基置于錐形瓶滅菌，滅菌完成后待其凝固前用移液槍取100～150 μL滴于雙孔凹玻片處，用解剖針取花粉置于培養基中，將其放入培養皿中（培養皿中事先放有濕濾紙），置于25 ℃光照培養箱中培養3 h。在光學顯微鏡下，觀察3個玻片6個凹孔，每個凹孔觀察5個視野，離體培養后花粉管明顯伸長的為有生活力的花粉，未伸長的為沒有活力的花粉。萌發率計算公式：萌發率=（已萌發的花粉粒數/總花粉粒數）×100%。

1.2.3 數據統計分析 所有試驗均重復3次，每次統計5個視野，采用Excel 2003、SPSS 13.0軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 I-KI法測定淡黃花百合花粉活力

由表1可知，開花前1 d至第3天，花粉活力不斷增強，第4天開始活力不斷降低，開花第3天花粉活力最高。開花后1～4 d花粉活力無顯著差異，維持在95%左右。開花前1 d花粉活力為78.97%，第5天花粉活力為82.53%。開花第6天、第7天花粉活力均低于50%，單花接近花謝期，明顯不適合進行雜交授粉。由此可知，開花后1～4 d淡黃花百合花粉活力較高，最適合授粉，如果與其他百合雜交出現花期不遇，也可在此時期采集花粉進行貯存。

2.2 TTC法測定淡黃花百合花粉活力

由表1可知，開花前1 d花粉活力為70.63%，開花當天花粉活力為73.57%，均較低;開花第2天至第4天花粉活力較高，第3天最高;開花第5天花粉活力為75.60%;第6天與第7天分別為43.50%、43.07%，已經降至50%以下。開花前1 d、開花當天及開花第5天均無顯著差異;開花第2、3、4天均無顯著差異;開花第6、7天無顯著差異。由此可知，花粉離體保存取花粉的最佳時期及雜交育種最佳授粉時間均為開花第2至第4天。endprint

表1 不同測定方法所測不同發育程度花粉活力

開放時間

（d）

花粉活力（%）

I-KI法 離體萌發法 TTC法

開花前1 d 78.97a 90.03a 70.63a

1 95.70b 86.70a 73.57a

2 95.40b 89.23a 91.20b

3 96.40b 97.13a 91.90b

4 94.27b 87.93a 84.90b

5 82.53a 75.10b 75.60a

6 48.13c 57.50c 43.50c

7 47.90c 39.57d 43.07c

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3 離體萌發法測定淡黃花百合花粉活力

由表1可知，開花前1 d至開花第4天，淡黃花百合花粉活力變化不明顯，開花第3天花粉活力最高;開花第5天開始花粉活力下降較快，第7天活力降至50%以下。由此可知，為了提高雜交育種的成功率，開花前1 d至開花第4天都可以進行授粉，開花第3天是最佳授粉時間，開花前1 d至開花第4天是離體保存最佳采集花粉時間。

2.4 3種不同測定方法比較

由表2可知，用3種不同方法測定淡黃花百合花粉活力由高到低依次為I-KI法>離體萌發法>TTC法。采用I-KI染色法測定的花粉活力與離體萌發法無明顯差異，這2種方法所得花粉活力與TTC染色法所得花粉活力差異極顯著。由于離體萌發法測定的花粉活力最接近真實值，因此離體萌發法被廣泛使用[14-16]。本試驗中，離體萌發法與I-KI染色法所得花粉活力無顯著差異，說明I-KI染色法適用于淡黃花百合花粉活力的測定。鑒于離體萌發法比I-KI 染色法程序復雜、耗時多、成本高，I-KI 染色法操作簡單、時間短，快速測定淡黃花百合花粉活力最佳方法為I-KI 染色法。

3 結論與討論

花粉活力對于研究花粉與柱頭的相互作用、基因庫的保持、不親和性與受精關系、生理調節對花粉萌發的影響等均有非常重要的意義。為了進行雜交授粉，通常要早期采集、貯存花粉，以解決花期不一致、遠距離雜交的問題，花粉活力直接

表2 3種不同測定花粉活力方法方差分析

測定方法 花粉平均萌發率（%）

I-KI法 79.91aA

TTC法 71.79bB

離體萌發法 77.90aA

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01）。

關系到育種效率[3]。本試驗結果表明，I-KI法、離體萌發法、TTC法測定的淡黃花百合花粉活力不完全相同。I-KI法、離體萌發法所得花粉活力無顯著差異，這2種方法都可用于淡黃花百合花粉活力的測定。趙統利等以卷丹百合為研究對象，認為I-KI法不適合用于花粉活力的測定[16]。郝瑞娟等也認為，萌發法比染色法能更準確地反映花粉的真實活力[8]。本試驗結果表明，I-KI法、離體萌發法所得花粉活力無顯著差異，由于I-KI法較離體萌發法簡單、成本低、所需時間短，因此是快速測定淡黃花百合花粉活力的最佳方法。開花第2至第4天花粉活力最高且無顯著差異，這幾天都可以進行雜交授粉，但從發育角度考慮，以開花第2天授粉最佳。

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