1株黑鯛致病性假交替單胞菌的鑒定及毒力基因分析

喬毅+沈輝+萬夕和+戚原野+王李寶

摘要：從患有尾鰭基部潰爛病的人工養殖黑鯛（Acanthopagrus schlegel）病灶處分離到1株優勢菌LSHD-1，經人工感染試驗證實為引起黑鯛尾鰭基部潰爛病病原菌。細菌形態學觀察、生理生化等表觀、生物學試驗、細菌16S rRNA基因同源性檢索和系統發育學分析結果表明，LSHD-1與假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）的吻合程度最高，系統發育分析結果與殺魚假交替單胞菌（Pseudoalteromonas piscicida）聚為1支。擴增細菌毒力基因，分析其潛在致病性，發現LSHD-1攜帶黏附侵襲位點基因（ail）、毒力活化因子（virF）、P4噬菌體整合酶基因（intB）、溶血素基因（hlyA）、絲氨酸蛋白酶基因（ahpA）、腸毒素基因（altA）、抗金屬蛋白酶基因（ast）。藥敏試驗結果顯示，LSHD-1對氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、頭孢曲松、氟苯尼考高度敏感，對磺胺異唑、強力霉素、青霉素G、四環素表現出較強耐藥性。

關鍵詞：黑鯛;假交替單胞菌;潰爛病;系統發育;毒力基因;藥物敏感性

中圖分類號： S941.42 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0229-04

收稿日期：2015-01-04

基金項目：江蘇省水產三新工程項目（編號：D2013-5-2） 。

作者簡介：喬 毅（1987—），男，碩士研究生，主要從事水產養殖病害防治技術研究。 E-mail：qiaoyishou@yeah.net。

通信作者：萬夕和，研究員，主要從事水產養殖病害防治技術研究。 E-mail：wxh1708@163.com。

假交替單胞菌屬是1995年Gauthier等根據細菌16S rRNA序列發現有別于假單胞菌（Pseudomonas）和交替單胞菌（Alteromonas）的一個新屬[1]，目前已經發現30多個種。該菌廣泛分布于海洋沉積物以及共附生在一些海洋動植物中。假交替單胞菌能產生胞外毒素、胞外多糖、胞外酶以及病毒活性物質等與致病相關的多種物質[2]，是一類條件致病菌。研究表明，假交替單胞菌可感染海水養殖藻類和養殖動物等，引起藻類溶藻、綠斑、黃斑[3-5]等，養殖動物皮膚潰爛[6]等疾病。 黑鯛（Acanthopagrus schlegel）屬于鱸形目鱸亞目鯛科魚類，主要分布在西太平洋區，在我國沿海均有分布，是海水魚養殖主要品種之一。近年來，江蘇沿海地區黑鯛在養殖過程中經常發生皮膚潰爛，并出現不同程度的死亡，給黑鯛養殖產業帶來嚴重威脅。2012年4月，江蘇省海水增養殖技術及種苗中心人工養殖黑鯛過程中發生皮膚潰爛，并出現一定規模的死亡。本試驗從患病魚體分離到1株優勢菌LSHD-1，對該菌進行了鑒定和毒力基因的研究，并進行了藥物敏感性試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

試菌株LSHD-1，分離自江蘇省海水增養殖技術及種苗中心的池塘養殖患皮膚潰爛病黑鯛，該菌株已通過回復感染證實為該病的病原菌。

2216E培養基、細菌微量生化鑒定管、水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂）、質控菌（大腸桿菌ATCC25922）及藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司;Premix Taq酶、DNA marker購自TaKaRa公司;引物（16S rRNA，毒力基因）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 形態結構觀察 用接種環挑取少量細菌在載玻片上涂片固定，革蘭氏染色，油鏡觀察形態。挑取單菌落細菌用海水制成菌懸液，吸取1滴置于銅網膜上，通過醋酸鈾染色，日立H-300型透射電子顯微鏡觀察。

1.2.2 生理生化試驗 參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《Bergeys Manual of Determinative Bacteriology》進行生理生化試驗。

1.2.3 細菌16S rRNA基因擴增 挑取單菌落于裝有 100 μL 滅菌去離子水的1.5 mL EP管中，煮沸10 min，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，上清即為聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）模板DNA，-20 ℃保存備用。采用通用引物擴增16S rRNA基因序列與測序，正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反向引物1492R（5′-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3′）。25 μL反應體系：12.5 μL Premix Taq酶，正、反向引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補足25 μL。反應條件：94 ℃5 min;94 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，35個循環;72 ℃10 min。PCR產物經1%瓊脂糖電泳（120 V，35 min）檢測目的片段（約1 500 bp）后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 系統發育分析 利用National Center for Biotechnology Information（NCBI）數據庫中blast對LSHD-1細菌16S rRNA序列進行相似性比較。使用ClustalX2.0軟件與從GenBank數據庫中獲得序列相似性較高的序列進行多序列比對，通過MEGA4（molecular evolutionary genetics analysis，MEGA）軟件采用鄰接建樹法構建系統發育樹，并通過Bootstrap法（1 000次）檢驗。

1.2.5 毒力基因檢測 通過PCR對LSHD-1菌黏附侵襲位點基因（ail）、耐熱腸毒素基因（ystB）、黏附素基因（yadA）、毒力活化因子（virF）、P4噬菌體整合酶基因（intB）、氣溶素基因（aerA）、溶血素基因（hlyA）、絲氨酸蛋白酶基因（ahpA）、腸毒素基因（altA）以及抗金屬蛋白酶基因（ast）進行擴增。擴增條件：ail、ystB、yadA、virF、intB按照94 ℃預變性4 min;94 ℃ 變性45 s、退火45 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸40 s，35個循環;72 ℃終延伸5 min。aerA、hlyA、ahpA、altA、ast基因94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s、退火30 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸30 s，35個循環;72 ℃終延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖電泳檢測結果。endprint

表1 檢測的毒力基因引物序列及反應條件

基因名稱 引物序列（5′→3′） 長度

（bp） 退火溫度

（℃）

Ail[7] F：TAATGTGTACGCTGCGAG;R：GACGTCTTACTTGCACTG; 351 50

ystB[7] F：CTTCAGATACTGGTGTCGCTGT;R：ATGCCTGACTAGAGCGATATCC 200 56

yadA[7] F：GGCAGAACAGCAGTCAGACATA;R：GGTGAGCATAGAGAATACGTCG 800 56

virF[7] F：GTACATTAGGCCAAGAGACG;R：GCAACATACCTCACAACACC 561 45

intB[7] F：TGCGCCATGCGGTCCATC;R：GGTGCATAAGATTCTCGG 714 50

aerA[8] F：CAAGAACAAGTTCAAGTGGCCA;R：ACGAAGGTGTGGTTCCAGT 309 57

hlyA[9] F：TGACAGGCAAGTAGAATAACGC;R：TGTCCGCTTTCCACTCCC 1 815 53

ahpA[10] F：GTTAGGCGTTGGCAATCTCG;R：CGCTGGAGTAGGAGGAACG 874 60

altA[11] F：ATCGTCAGCGACAGCTTCTT;R：CTCATCCCTTGGCTTGTTGT 442 58

ast[12] F：TGACCCAGTCCTGGCACGGC;R：GCTGATCGATCACCACCAGC 504 57

1.2.6 藥物敏感性試驗 選擇磺胺異唑、強力霉素、氧氟沙星、青霉素G、恩諾沙星、新霉素、頭孢曲松、四環素、紅霉素、諾氟沙星、氟苯尼考藥敏試紙片對LSHD-1進行敏感性試驗，采用世界衛生組織推薦的K-B紙片瓊脂擴散法進行，結果按敏感（S）、中敏（I）、耐藥（R）報告[13]。

2 結果與分析

2.1 細菌形態學特征

LSHD-1菌落在2216E瓊脂平板上為淺黃色，凸透鏡狀，表面光滑濕潤有光澤，邊緣完整，不透明，圓形。革蘭氏染色陰性，呈短桿狀（圖1）。負染后電鏡觀察，菌體呈短桿狀，極端單鞭毛（圖2）。

2.2 生理生化特征

LSHD-1菌氧化酶試驗陽性，L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸和L-色氨酸反應陰性（表2），結合伯杰氏手冊，該生理生化結果與假交替單胞菌基本符合。

2.3 分子生物學鑒定及系統發育學分析

PCR擴增LSHD-1菌16S rRNA基因獲得1條清晰的條

表2 LSHD-1生理生化試驗

反應（酶） 結果 反應（酶） 結果

鳥氨酸脫羧酶 - 吲哚（產生） -

精氨酸雙水解酶 - N-乙酰-β-葡萄糖苷酶 +

賴氨酸脫羧酶 - β-半乳糖苷酶 -

脲酶 - 葡萄糖（產酸） -

L-阿拉伯糖醇（產酸） - 蔗糖（產酸） -

半乳糖羧鹽（產酸） - L-阿拉伯糖（產酸） -

5酮基-葡萄糖酸（產酸） - D-阿拉伯醇（產酸） -

肢酶 - α-葡萄糖苷酶 +

酚紅（產酸） - α-半乳糖苷酶 -

β-葡萄糖苷酶 + 海藻糖（產酸） -

甘露醇（產酸） - 鼠李糖（產酸） -

麥芽糖（產酸） - 肌醇（產酸） -

側金盞花醇（產酸） - 纖維二糖（產酸） -

帕拉金糖（產酸） - 山梨醇（產酸） -

β-葡萄糖酸苷酶 - 麥芽糖苷酶 -

丙二酸 - L-天冬氨酸芳胺酶 +

帶，經測序后發現為1 438個堿基的基因片段，將該序列在NCBI數據庫進行blast分析對比，發現LSHD-1與假交替單胞菌殺魚亞種的同源性最近，達99%。將測得序列與GenBank中已登錄的16S rRNA序列進行匹配排列，構建系統進化樹，結果LSHD-1與假交替單胞菌殺魚亞種聚為1支（圖3）。

2.4 毒力基因檢測結果

PCR擴增LSHD-1細菌毒力基因，經電泳檢測發現：altA、ail、intB、ahpA、ast、virF、hlyA基因（圖4、圖5）出現相應大小的條帶，其中絲氨酸蛋白酶基因（ahpA）條帶最為清晰，altA、intB、virF條帶比較清晰，ail、ast、hlyA條帶相對較弱。

2.5 藥物敏感性試驗

藥敏試驗結果表明，LSHD-1菌對氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢曲松、諾氟沙星、氟苯尼考敏感;對磺胺異唑、強力霉素、青霉素G、四環素表現出耐藥;磺胺異唑和青霉素G對LSHD-1菌的抑菌效果較差（表3）。

3 討論

假交替單胞菌是海洋中常見的細菌，隨著海水養殖業的發展，假交替單胞菌受到廣泛的關注和研究。目前，日本有關

于假交替單胞菌引起海帶（Laminaria）孢子體紅點病[14]和孔爛癥[15]的報道，我國也有假交替單胞菌引起條斑紫菜（Porphyrae yezoensis）綠斑病[4]和黃斑病[5]的報道;Pujalte等從患病的海鱸體內分離到1株Pseudoalteromonas undina，試驗發現其毒性較弱，但是在養殖環境惡化時引起金頭鯛和海鱸患病[16];國內大量研究表明，假交替單胞菌可引起刺參（Apostichopus japonicus）腐皮病[17-19]、潰瘍病[20]等;喬遷等報道假交替單胞菌引起七帶石斑魚（Epinephelus septemfasciatus）皮膚潰爛[21];白雪松等從群體死亡日本對蝦（Penaeus japonicus）蚤狀幼體中分離到1株致病菌，經鑒定為Pseudoalteromonas lipolytica[22]。本試驗從患病黑鯛病灶處分離到1株優勢菌LSHD-1， 革蘭氏染色和透射電鏡觀察結果與假交替單胞菌endprint

表3 LSHD-1藥物敏感性試驗結果

藥敏試紙

名稱 藥物含量

（μg/片）

抑菌圈大?。╩m）

ATCC25922 LSHD-1

敏感性

磺胺異唑 300 24.6 0 R

強力霉素 30 18.4 8.0 R

氧氟沙星 5 31.5 23.4 S

青霉素G 10 15.7 0 R

恩諾沙星 15 38.0 26.6 S

新霉素 30 23.5 16.7 I

頭孢曲松 30 34.0 27.9 S

四環素 30 21.5 13.5 R

紅霉素 15 35.6 15.8 I

諾氟沙星 10 24.3 18.7 S

氟苯尼考 30 34.6 22.4 S

的特征基本一致;根據生理生化表型特征，LSHD-1菌與假交替單胞菌相似度最高;另外，LSHD-1細菌的16S rRNA基因序列在NCBI數據庫中通過blast同源性檢索，基因序列與假交替單胞菌殺魚亞種的同源性最高，達到99%，從基因系統發育樹來看，LSHD-1與假交替單胞菌殺魚亞種聚為1支。綜合LSHD-1的形態學特征、生理生化和分子生物學鑒定結果，認為LSHD-1為假交替單胞菌殺魚亞種。

黑鯛在養殖過程中，相關報道過有擬態弧菌（Vibrio mimicus）引起的幼魚腹水病[23]、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）[24]與遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）[25]引起的大規模死亡。假交替單胞菌殺魚亞種感染黑鯛的研究未見報道，毒力人工回感試驗結果表明，該株菌為引起黑鯛尾鰭基部潰爛病的病原菌;通過擴增LSHD-1菌的毒力基因，結果檢測到黏附侵襲位點基因（ail）、毒力活化因子（virF）、P4噬菌體整合酶基因（intB）、溶血素基因（hlyA）、絲氨酸蛋白酶基因（ahpA）、腸毒素基因（altA）、抗金屬蛋白酶基因（ast）。ail基因能夠編碼對宿主產生高度黏附并保護細菌不被宿主免疫系統殺滅的小分子黏附蛋白[26]，目前，ail基因在小腸耶爾森氏菌中研究較多[7，27-28]，有學者甚至認為，可將ail基因作為小腸耶爾森氏菌致病性指示基因[29];ahpA基因是細菌重要的致病基因之一，其主要在病原入侵過程中通過活化毒力因子間接發揮作用[30]，張璐等利用缺失突變法構建遲緩愛德華氏菌ahpA基因突變菌株，通過與野生菌株的侵染試驗的比較，認為ahpA基因對遲緩愛德華氏菌前期侵染宿主有關[31]，朱大玲等研究表明，ahpA基因陽性的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）為有毒菌[32];hlyA基因是多數致病細菌的常見基因，關于其在致病過程中所起的作用，付喬芳等認為，hlyA基因與嗜水氣單胞菌的致病力關系不大[33]，但黃鈞等發現攜帶hlyA基因的氣單胞菌致病力增強[34];virF基因是編碼毒力基因的調控因子[35]，在細菌致病性中起著重要作用，altA、ast基因在已有報道中證實與致病性關系不大[33]。本試驗還擴增到intB基因，與茍小蘭等的試驗結果[7]一致，說明LSHD-1染色體上存在高致病性毒力島。綜上可以推斷，本試驗分離的致病性殺魚假交替單胞菌的致病力可能主要由ail、ahpA、virF、intB基因決定。毒力基因的量、毒力基因的表達機理以及毒力基因間的相互作用與致病性的關系非常復雜，引起黑鯛的致病機制尚需進一步研究。

LSHD-1藥物敏感性試驗結果與喬遷等的研究結論[21-22]基本一致，氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、頭孢曲松、氟苯尼考對LSHD-1有較好的抑菌效果;該菌對磺胺異唑、強力霉素、青霉素G、四環素表現出較強耐藥性。但是總體藥物敏感性比淡水菌敏感，這可能是因為海水養殖抗菌藥物使用的頻率不高，細菌在沒有抗菌素環境壓力下保持了較高的藥物敏感性。該菌的藥物敏感性試驗結果可為防治該菌引起的水生動物疾病提供借鑒和參考。

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