白芨種子無菌萌發特性

李雨晴+楊嘉偉+王康才+梁永富+陳紅麗+徐益祥+夏天爽

摘要：為探討白芨[B.striata（Thunb.）Teichb.f.]種子無菌萌發適宜條件，采用1/2 MS、MS添加不同激素、生物添加劑，以及光暗處理進行白芨種子萌發試驗。結果表明：1/2 MS+1.0 mg/L NAA+1.6 mg/L 6-BA有利于種子萌發;1/2 MS+30 g/L蔗糖+20%椰汁有利于誘導原球莖;暗培養降低白芨種子萌發率，白芨種子萌發后，其幼苗在光照條件下生長緩慢。

關鍵詞：白芨;無菌萌發;發芽勢;

中圖分類號： S567.23+9.04 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0253-02

收稿日期：2014-05-22

基金項目：江蘇省鎮江市農業項目（編號：R0201100292）。

作者簡介：李雨晴（1991—），女，碩士研究生，主要從事藥用植物栽培與生理研究。E-mail：2013804133@njau.edu.cn。

通信作者：王康才，教授，主要從事藥用植物栽培與生理研究。E-mail：wangkc@njau.edu.cn。

白芨[Bletilla striata （Thunb.）Teichb.f.]為蘭科白芨屬多年生草本植物，以干燥塊莖入藥，性微寒，味苦、甘、澀，具有補肺、止血、散風除濕、通竅止痛、消腫排膿、生肌、斂瘡等功效，主治咳血吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、肺結核咳血、潰瘍病出血等癥[1]。白芨種子細小、無胚，在野生條件下很難萌發。人工采挖導致白芨野生資源緊缺，迫切需要進行人工栽培。白芨蒴果包含上萬粒種子，利用組織培養技術對白芨進行無菌萌發，可以提高其萌發率，得到大量組培苗，是解決傳統分株繁殖效率低的重要手段[2-5]。為進一步優化白芨種子的發芽條件，本研究探討白芨無菌萌發條件及幼苗生長特性，以期為白芨快速繁殖提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

白芨于2013年8月采自南京農業大學中藥材試驗大棚，經南京農業大學中藥材研究所王康才教授鑒定為白芨的蒴果。

1.2 方法

白芨蒴果采集后，先用洗滌劑漂洗蒴果表面，再用流水沖洗30 min。在超凈工作臺上用75%乙醇浸沒30 s，無菌水沖洗后經HgCl2消毒15 min，其間不停搖動，無菌水沖洗3～4遍，用無菌濾紙吸干白芨蒴果表面水分。蒴果縱剖，將種子均勻抖落在培養基表面?；九囵B基為1/2 MS，均添加蔗糖 30 g/L、瓊脂粉6 g/L（除特殊說明而外）。培養基滅菌前加入不同生物添加劑（馬鈴薯提取液、椰汁）以及不同濃度激素（NAA、6-BA），設置5×5完全隨機區組。培養基高溫滅菌前調節pH值至5.6，121 ℃下滅菌30 min，每處理接種5瓶，每瓶300～400粒種子。暗培養以黑暗條件下培養30 d后置于光下，其余處理為12 h/12 h光暗培養，照度2 000～2 500 lx，培養溫度均為（25±1） ℃。統計各處理白芨種子發芽率、發芽勢，原球莖誘導率及株高。發芽勢以培養20 d時的萌發率計，幼苗株高以培養50 d時計。

1.3 數據分析

用SPSS軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 不同處理下白芨種子萌發、幼苗發育過程

白芨種子接種至各不同培養基上1周后開始膨大，顏色由灰白轉綠。2周后可見葉芽從膨大的種胚一端頂出，添加高濃度激素的培養基上葉芽粗壯。3周后，葉芽變綠。數周后葉片展開。添加椰汁的培養基上葉芽生長緩慢，種胚持續膨大形成原球莖。培養50 d，原球莖誘導率分別達87.3%、92.3%，未見葉片展開（圖1）。培養60 d，添加激素的培養基中白芨幼苗莖基粗壯，葉片向上展開，未見生根。1/2 MS培養基上白芨葉片自基部展開，葉片向四周展開，葉尖微垂，少數植株生根。暗培養的白芨種子萌發率低，種胚膨大后不形成原球莖，直接萌發為細弱的幼苗;幼苗移至光下后，生長十分緩慢。

2.2 基本培養基、生物添加劑及光周期對白芨種子萌發的影響

由表1可見，培養40 d，除暗培養處理外，各培養基上白芨種子發芽率均可達到90%以上。與1/2 MS相比，添加 1.0 mg/L NAA能明顯提高白芨種子發芽率并促進幼苗生長。以1/2 MS為基本培養基時，白芨種子發芽勢高，生活力更旺盛。以MS為基本培養基有利于提高白芨幼苗株高，促進其生長。馬鈴薯提取液對白芨萌發促進作用較小，甚至抑制了幼苗的生長。

2.3 激素對白芨種子無菌萌發的影響

不同濃度激素處理對白芨種子萌發有顯著影響。添加1.0 mg/L NAA、1.6 mg/L 6-BA的培養基上，白芨種子發芽勢較高（94.4%），幼苗株高達1.190 cm;添加0.2 mg/L NAA及1.2 mg/L 6-BA的培養基上，白芨種子發芽勢最低（186%），幼苗較矮（0.104 cm）（表2、表3）。

表1 不同處理對白芨種子萌發的影響

培養基

發芽率（%）

20 d 30 d 40 d

株高

（cm）

1/2 MS+1.0 mg/L NAA 88.2±1.924ab 95.4±1.673a 97.0±2.449a 0.348±0.015b

MS+1.0 mg/L NAA 78.4±2.074c 96.6±3.209a 97.6±1.140a 0.398±0.016a

1/2 MS+馬鈴薯提取液 65.0±1.581d 83.4±2.510b 91.4±1.140b 0.252±0.036c

1/2 MS+20%椰汁 86.6±2.702b 96.8±1.304a 97.6±1.517a 0.206±0.021dendprint

1/2 MS+30 g/L蔗糖+20%椰汁 89.8±1.304a 95.6±1.517a 96.2±2.168a 0.352±0.041b

1/2 MS暗培養 27.4±1.817f 45.8±1.095d 46.4±3.435c 0.112±0.013e

1/2 MS 60.8±1.924e 79.4±3.715c 90.2±0.837b 0.368±0.036ab

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

表2 不同激素對白芨種子發芽勢的影響

6-BA濃度

（mg/L）

發芽勢（%）

NAA濃度0.2 mg/L NAA濃度0.4 mg/L NAA濃度0.6 mg/L NAA濃度0.8 mg/L NAA濃度1.0 mg/L

0.4 44.2±4.970k 60.2±3.421i 42.0±3.606k 81.2±6.496cd 87.2±3.563b

0.8 35.2±4.764l 42.2±3.271k 53.0±4.301j 71.2±4.970fg 82.0±2.828cd

1.2 18.6±1.517n 24.6±2.302m 31.2±1.483l 44.4±2.074k 59.6±2.966i

1.6 74.6±2.702f 79.8±2.774de 84.6±3.782bc 89.0±2.915b 94.4±1.673a

2.0 64.8±2.280h 69.8±2.775g 75.6±2.966ef 73.0±3.240fg 79.6±5.030de

注：所有數據后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

表3 不同激素對白芨幼苗株高的影響

6-BA濃度

（mg/L）

株高（cm）

NAA濃度0.2 mg/L NAA濃度0.4 mg/L NAA濃度0.6 mg/L NAA濃度0.8 mg/L NAA濃度1.0 mg/L

0.4 0.094±0.038j 0.232±0.029ghi 0.386±0.058f 0.436±0.047f 1.050±0.156b

0.8 0.296±0.028g 0.312±0.038g 0.392±0.071f 0.448±0.048f 0.812±0.061d

1.2 0.104±0.011j 0.198±0.037i 0.292±0.026gh 0.712±0.037e 0.874±0.113d

1.6 0.212±0.026hi 0.242±0.038ghi 0.272±0.029ghi 0.970±0.051c 1.190±0.042a

2.0 0.242±0.018ghi 0.402±0.026f 0.806±0.111d 0.834±0.043d 1.000±0.066bc

注：所有數據后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.4 不同激素對白芨萌發影響的多重比較

由表4可知，白芨種子發芽勢、幼苗株高在一定范圍內隨著6-BA、NAA濃度的增大而升高。6-BA濃度達1.6 mg/L時，白芨種子發芽勢最大。與添加NAA的培養基相比，添加6-BA白芨種子發芽勢極差較高，但幼苗株高極差偏低，表明NAA對白芨種子發芽勢影響較6-BA小，但對幼苗生長促進作用較強。

3 結論與討論

蘭科植物種子細小，成熟時種皮細胞質、細胞器退化消失，成為死細胞[6]。胚發育不完全，缺乏供給營養成分的胚乳，自然條件下難以萌發。白芨為陸生蘭類，陸生蘭為適應其生長環境，其種子具有厚種皮及含有抑制萌發的物質性質[7]，其種子發芽較氣生蘭更困難。無菌培養白芨種子，必須提供其萌發所需的各種物質，椰汁、馬鈴薯提取液等生物添加劑能提高發芽率、發芽速度[6]，這與本研究結果基本相符。本試驗發現，椰汁能誘導白芨種子直接形成原球莖，旦抑制幼苗生

表4 6-BA、NAA濃度對白芨萌發的影響

激素 濃度（mg/L） 發芽勢（%） 株高（cm）

6-BA 0.4 62.96±19.379c 0.435±0.347b

0.8 56.72±18.281d 0.452±0.198b

1.2 35.68±15.146e 0.436±0.312b

1.6 84.48±7.512a 0.577±0.427a

2.0 72.56±6.001b 0.657±0.297a

極差 48.80百分點 0.222

NAA 0.2 47.48±20.821d 0.185±0.089e

0.4 55.32±20.326c 0.277±0.080d

0.6 57.28±20.713c 0.430±0.207c

0.8 71.76±15.870b 0.680±0.219b

1.0 80.56±12.282a 0.985±0.162a

極差 33.08百分點 0.800

注：同一激素處理同列數據后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

長，這可能與椰汁含有的激素種類和濃度有關。生長素、細胞分裂素在種子萌發過程中起著重要作用，尤以后者作用更為明顯[8]。本研究發現，6-BA對白芨種子發芽的促進作用較NAA更為明顯，這與前人研究相符。MS是成分比較完全的

培養基，1/2 MS雖與之成分相同，但大量元素減半。本研究結果表明，1/2 MS作為種子萌發培養基可以提高其發芽勢，猜測高濃度鹽離子影響細胞滲透勢導致發芽勢降低。發芽后應盡快將幼苗轉接至MS培養基上壯苗，添加激素輔助其幼苗繼續生長。光是影響種子萌發的重要因素之一，本研究發現，白芨種子萌發初期需光，暗培養的白芨種子萌發率低，轉至光下萌發率未見顯著增長，但可在無激素培養基上維持幼苗期長達數月，直至添加激素打破其生長停滯。這一發現對保存白芨種質及人工調控溫室白芨苗生長期具有重大意義。綜上所述，在12 h/12 h光周期下，考慮以1/2 MS+1.0 mg/L NAA+1.6 mg/L 6-BA為萌發培養基較為適宜;以1/2MS+20%椰汁為培養基獲得白芨原球莖。白芨種子萌芽初期細小，不宜轉接，因此對于種子萌發培養基不僅要評價其提高種子活力的能力，而且要考慮其促進幼苗生長的作用。

參考文獻：

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[8]Thompson D I，Edwards T J，Staden J V. Evaluating asymbiotic seed culture methods and establishing Disa （Orchidaceae） germinability in vitro：relationships，requirements and first-time reports[J]. Plant Growth Regul，2006，49（2/3）：269-284.endprint