金納米顆粒在食品抗氧化能力評價中的檢測應用

馬滔+馬小媛+王周平

摘要：選取沒食子酸、咖啡酸、原兒茶酸、阿魏酸、香草酸5種酚酸化合物和康師傅東方樹葉、農夫山泉水溶C100這2種茶飲料作為還原劑，誘導金納米顆粒的生長，并利用分光光度計測定所形成金納米顆粒的吸光度，以評價各試驗物質的抗氧化能力。結果表明，5種酚酸化合物抗氧化能力從強到弱依次為沒食子酸>咖啡酸>原兒茶酸>香草酸>阿魏酸;2種茶飲料抗氧化能力從強到弱依次為農夫山泉水溶C100>康師傅東方樹葉綠茶。通過與傳統清除2，2-二苯基-1-苦基肼自由基（DPPH·）水平以評價抗氧化能力的方法相比，基于金納米材料檢測抗氧化劑抗氧化能力的方法準確可靠、操作簡單、響應迅速，值得推廣應用。

關鍵詞：金納米顆粒;抗氧化能力;酚酸化合物;DPPH·

中圖分類號： TS201.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0282-04

收稿日期：2014-05-16

基金項目：國家自然科學基金（編號：21375049）;國家科技支撐計劃（編號：2012BAK08B01）;江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2012614）。

作者簡介：馬 滔（1992—），女，陜西寶雞人，從事食品安全檢測研究。E-mail：ch_matao@163.com。

通信作者：馬小媛（1983—），女，江蘇南京人，博士，副教授，從事食品安全檢測研究。E-mail：maxy@jiangnan.edu.cn。

生物體系中的氧化與抗氧化系統失衡會導致氧化應激，具有抗氧化能力的物質能有效抵御氧化應激的有害損傷。食品中的抗氧化劑日益引起人們的關注，對飲食中潛在的抗氧化劑及其抗氧化能力實現簡單、可靠、快速的檢測變得尤為重要。傳統的抗氧化能力檢測方法主要包括清除生物體內活性氧/活性氮自由基、清除非生物體內穩定自由基和總還原能力檢測等，如檢測ROO·、H2O2、ONOO—清除能力等[1-4]，這些檢測方法大多基于化學試劑和化學反應，在實際應用中存在危害人體健康、破壞生態環境等問題而受到諸多限制。隨著納米科技的興起與發展，納米材料以其特有的物理、化學性質在生物學、化學、免疫學等領域展現出廣闊的應用前景，納米材料應用于食品功能評價正快速發展。Jiang等利用硒化鎘量子點（CdSe QDs）的電化學發光效應研發出一種檢測HO·清除能力的方法[5];Kim等于2005年提出一種利用包埋有辣根過氧化物酶的聚合物小球評價細胞內氧化應激水平的光學納米傳感方法[6]。

酚酸是非常重要的天然抗氧化劑，屬苯丙素類化合物，多為對羥基苯甲酸和對羥基苯丙烯酸（肉桂酸）的衍生物，如沒食子酸（C7H6O5）、咖啡酸（C9H8O4）、原兒茶酸（C7H6O）、阿魏酸（C10H10O4）、香草酸（C8H8O4）等，廣泛存在于植物體內。研究表明，酚酸類成分具有抗血栓、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌保肝等多種生物活性。Soobrattee等采用Trolox等價抗氧化能力、鐵離子還原抗氧化及次氯酸鹽清除能力等抗氧化測定體系，對酚酸的抗氧化進行評定，結果表明，酚酸具有較強的抗氧化能力，是良好的抗氧化劑;對活性氧自由基具有清除作用，可用DPPH·法定性測定不同酚酸的抗氧化性能力[7]。

本研究采用沒食子酸、咖啡酸、原兒茶酸、阿魏酸、香草酸等系列酚酸化合物及東方樹葉綠茶、水溶C100這2種茶飲料誘導金納米生長，利用金納米顆粒獨特的光學性質，產生規律性變化的紫外-可見-近紅外吸收峰，根據吸收峰的變化來比較酚酸化合物及茶飲料的抗氧化能力，并與傳統的清除DPPH·自由基檢測方法進行較，以期建立一種基于金納米材料檢測抗氧化劑抗氧化能力的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

UV-1800PC分光光度計，日本島津公司生產;DK-S22電熱恒溫水浴鍋;BS124S分析天平;透射電子顯微鏡（TEM）。

1.2 試劑與材料

沒食子酸、咖啡酸、原兒茶酸、阿魏酸、香草酸、十六烷基三甲基溴化銨（C19H42NBr）、氯金酸（HAuCl4）、檸檬酸鈉（C6H5Na3O7）、水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、維生素C（C6H8O6）、2，2-二苯基-1-苦基肼自由基（DPPH·），均購于阿拉丁試劑公司;康師傅東方樹葉綠茶、農夫山泉水溶C100，均購于大型超市。

1.3 維生素C還原納米金顆粒標準當量測定

1.3.1 試驗原理 維生素C（圖1）能抗壞血病，廣泛存在于新鮮水果蔬菜及許多生物中，作為一種高活性物質參與新陳代謝過程，是一種強抗氧化劑，能還原Au（Ⅲ）形成金納米顆粒。由于金納米顆粒大小及形貌的變化，使其局域表面等離激元共振吸收峰產生規律性變化。因此，可以選擇維生素C作為標準樣劑，并作為當量與其他物質反應結果進行比對。

1.3.2 試驗步驟 準確稱取維生素C標準品17.612 g，溶解定容至100 mL，搖勻，配制成1 mol/L維生素C標準液;將標準液分別稀釋成0.000 1、0.001、0.01、0.1、1 mol/L的樣液，分別取0.5 mL樣液，加入到含有100 μL 10 mmol/L AuCl-4、600 μL 3.7 mmol/L CTAB、300 μL 0.2 mmol/L檸檬酸鈉、3.5 mL 0.12 mol/L pH值為 8.0磷酸緩沖液中， 混勻; 45 ℃

水浴10 min，取出，放至室溫，均質后測定350～700 nm 的紫外吸收光度。

1.4 酚酸類化合物還原納米金顆粒

1.4.1 試驗原理 酚酸化合物（圖2）由于苯環上酚羥基的還原性，在溶液中不需要金種子的催化即能還原Au（Ⅲ）形成金納米顆粒，其光學吸收強度與酚酸類物質的抗氧化能力呈正相關[8]。endprint

1.4.2 試驗步驟 把100 μL 10 mmol/L HAuCl4、600 μL 3.7 mmol/L CTAB和300 μL 0.2 mmol/L檸檬酸鈉連續加入到3.5 mL 0.12 mol/L 磷酸緩沖液（pH值為 8.0）中，混勻;取0.5 mL 0.01 mol/L試驗樣品加入混合液中，45 ℃ 水浴 10 min;將混合物迅速移出，冷卻至室溫，均質后測定350～700 nm的紫外吸光度[9]。以0.5 mL超純水代替0.5 mL待測樣品作為對照。

1.5 DPPH·自由基法測定酚酸類物質抗氧化性

1.5.1 試驗原理 DPPH·是一種商業化的非常穩定的自由基，含苯環結構（圖3），其乙醇溶液顯紫色，在515 nm處有強烈的光學吸收，且吸收峰位置相對穩定?？寡趸瘎┦且环N常見的自由基清除劑，清除能力基于抗氧化劑結構上的特性，包括羥基中O—H 鍵解離能、抗氧化劑失去電子形成苯氧自由基的鍵共振解離能及芳環上取代基團的空間位阻效應。清除化學反應的方程式為：DPPH·+PheOH→DPPHH+[PheO（Ⅰ）、PhO（Ⅱ）、PhO（Ⅲ）…]，其中，（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）為不同的共振結構，并基于以下理論終止反應：DPPH·+DPPH·→DPPH-DPPH、DPPH·+PheO·→DPPH-PheO、PheO·+PheO·→PheO-PheO，從而決定各種抗氧化劑清除 DPPH·水平的大小[10]。

1.5.2 試驗步驟 稱取0.004 g DPPH·溶于100 mL無水乙醇中，得0.101 4 mmol/L的DPPH·乙醇溶液;分別取 0.05 mL 不同濃度的抗氧化劑待測物乙醇溶液加入到 3.95 mL 0.101 4 mmol/L DPPH·乙醇溶液中，用分光光度計每隔一段時間檢測其UV-vis-NIR吸收光譜并記錄，直到反應液的吸光度保持相對穩定、不再變化為止。

2 結果與分析

2.1 不同濃度維生素C誘導金納米顆粒的生長

由圖4可見，不同濃度維生素C與氯金酸反應后，在500～600 nm處出現強烈的吸收峰，并且隨著濃度的增加，吸收峰強度越來越高，這說明維生素C的抗氧化性能力與吸收峰的峰值有相關性。維生素C具有較強的還原性，會誘導氯金酸溶液生成金納米顆粒，并產生特殊光學效應。因待測液濃度均為0.01 mol/L，所以選擇0.01 mol/L，此時維生素C誘導生成金納米顆粒的最大吸光度作為標準單位，與其他待測液進行比較（圖5）。

2.2 不同酚酸化合物誘導納米金的生長

由圖6可以看出，5種酚酸中，沒食子酸紫外吸收峰強度最大，對應的反應溶液顏色也最深，呈深紫紅色，其后依次為咖啡酸、原兒茶酸、香草酸和阿魏酸。在弱堿介質下，酚酸形成的相應苯氧自由基的親核性會影響酚酸抗氧化能力，并通過共振或分子內氫鍵而穩定。羧酸基團是常見的吸電子基團，能通過降低芳香環的電子密度來穩定苯氧自由基;

—CHCH—COOH 連接在苯環上，通過共振提高苯氧自由

基的穩定性而提高供氫能力[11]。根據5種酚酸化合物的結構式可知，沒食子含有3個酚羥基和1個羧基，其失電子后結構最為穩定;咖啡酸含2個酚羥基和1個—CHCH—COOH，原兒茶酸含2個酚羥基和1個羧基，其酚羥基數量均比沒食子酸少，則失氫能力弱于沒食子酸;香草酸和阿魏酸都只含有1個酚羥基，還原性最弱。把5種酚酸物質的最大吸光度與 0.01 mol/L 的維生素C進行比對，沒食子酸相當于1.12倍維生素C，咖啡酸相當于0.76倍維生素C，香草酸相當于0456倍維生素C，阿魏酸相當于0.313倍維生素C。

由圖8可見，沒食子酸還原出的金納米顆粒最多，其次是原兒茶酸，最后是阿魏酸。結合5種酚酸物質誘導金納米顆粒的紫外光譜及結構分析，可知5種酚酸物質的抗氧化性能依次為：沒食子酸>咖啡酸>原兒茶酸>香草酸>阿魏酸。

2.3 酚酸化合物對DPPH·清除能力的評價

由圖9、圖10可見，加入抗氧化待測物后的最初幾分鐘內，峰強度迅速降低，峰位置不變，這表明反應體系內 DPPH· 被部分清除，并且清除速率較快;隨著反應的繼續進行，峰強度降低的速率逐漸減慢，并保持相對穩定的水平。

以加入反應體系的抗氧化劑與DPPH·的相對量（摩爾比）為橫坐標，以不同濃度抗氧化劑清除DPPH·后反應體系內的剩余DPPH·量作為縱坐標作曲線（圖11-A）;同樣，以加入反應體系的抗氧化劑與DPPH·的相對量（摩爾比）為橫坐標，以不同濃度抗氧化劑清除DPPH·后反應體系達到穩定水平所需要的時間作為縱坐標作曲線（圖11-B）。取剩余量為50%時的濃度為IC50值，將抗氧化劑濃度為 IC50值時所對應的反應時間定義為TIC50，將DPPH·的清除能力定義為AE=1/（IC50TIC50）。AE和1/IC50可反映抗氧化劑清除DPPH·的能力，數值大小反映酚酸化合物清除DPPH·能力的強弱。

由表1可見， 沒食子酸清除的DPPH·能力最強，其次是咖啡酸、原兒茶酸、水溶C100、東方樹葉綠茶、香草酸，阿魏酸最弱。對DPPH·自由基清除能力的檢測作為一種傳統的抗氧化能力檢測法，被廣泛用于各種抗氧化劑抗氧化能力的表征，其中，DPPH·是一種人工合成、穩定的商業自由基，試驗操作簡單、數據可靠。試驗結果表明，5種酚酸物質對DPPH·的清除能力與基于GNPs生長過程的納米材料光學檢測法所得結果一致。

2.4 實際樣品誘導納米金顆粒生長

水溶C100中含有維生素C，東方樹葉綠茶中含茶多酚，2種物質均能夠誘導金納米顆粒生長。由圖12、圖13可見，以0.01 mol/L的維生素C作為當量，水溶C100相當于0.587倍

表1 5種酚酸物質和2種茶飲料清除DPPH·自由基的能力endprint

物質 IC50 1/IC50 TIC50

（min） AE

（mmol/mol） 反應情況

沒食子酸 0.015 66.667 10.2 6 600.667 快，迅速

咖啡酸 0.126 7.937 13.4 999.938 快，較迅速

原兒茶酸 0.238 4.200 36.7 114.487 較快，中速

香草酸 48.439 0.020 6 44.1 0.468 慢，低速

阿魏酸 76.316 0.013 1 51.4 0.255 慢，低速

東方樹葉 0.289 3.745 38.8 93.529 較快，中速

水溶C100 0.267 3.460 37.2 96.016 較快，中速

維生素C，東方樹葉綠茶相當于0.567倍維生素C。由表1可見，根據AE值，2種茶飲料還原性從強到弱為水溶C100>東方樹葉綠茶。

3 結論

本試驗通過不同濃度的維生素C與氯金酸相互作用生成金納米顆粒，采用分光光度法測定生成金納米顆粒的吸光度，表明抗氧化劑的抗氧化性與吸光度之間存在著正相關關系。采用相同的方法，用5種不同的酚酸化合物和2種飲料與氯金酸相互作用，測定其吸光度，以表征7種不同物質的抗氧化能力，結果表明，酚酸化合物還原能力從強到弱依次為沒食子酸>咖啡酸>原兒茶酸>香草酸>阿魏酸，2種茶飲料抗氧化能力從強到弱依次為水溶C100>東方樹葉綠茶。通過與傳統清除DPPH·水平評價抗氧化能力的方法相比，證實應用金納米顆粒測定抗氧化劑抗氧化能力的方法可靠、準確、簡單、快速，具有廣闊的實際應用前景。

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