Folin—Ciocalteu法測定濃縮還原橙汁中總酚含量

牛燦杰+陳小珍+張慧+莫衛民+王展華+吳雨

摘要：研究福林-酚（Folin-Ciocaileu）法測定濃縮還原橙汁（refrigerated orange juice from concentrated，ROJFC）中總酚含量的最佳反應條件，比較不同產地商品100%濃縮還原橙汁中的總酚含量。結果表明：福林試劑的濃度為 0.25 mol/L、Na2CO3的質量分數為12.5%、反應時間為20 min、反應溫度為60 ℃時，在0～12 μg/mL范圍內，濃縮還原橙汁中多酚含量與其對應的吸光度有良好線性關系（r2=0.998 9），該方法重現性好、精密度高（RSD<2.0%），回收率范圍為99.3%～102.3%;不同產地商品濃縮還原橙汁總酚含量差異較大，介于571.80～1 101.33 μg/mL。研究結果為進一步研究濃縮還原橙汁的飲用價值提供了技術支持與數據參考。

關鍵詞：濃縮還原橙汁;福林（Folin-Ciocaileu）法;總酚含量;反應條件

中圖分類號： TS275.5 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0291-03

收稿日期：2014-06-05

基金項目：國家科技部質檢公益性行業科研專項（編號：201310150）。

作者簡介：牛燦杰（1988—），女，河南平頂山人，碩士研究生，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：ncjlxx@163.com。

通信作者：陳小珍，教授級高級工程師，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：cxz730@163.com。

隨著人們生活水平的提高，果汁的需求量及消費量逐年增長，橙汁則因其口感好、營養豐富等特點成為國際市場上消費量最大的果汁之一。目前，市場上銷售的橙汁主要有濃縮還原橙汁（from concentrated juice，FC）和鮮榨汁（not from contrated juice，NFC），濃縮還原橙汁因其貯存期長、運輸方便、調配簡單、成本低等優點占世界橙汁銷量的75%[1]。濃縮還原橙汁中富含許多對人體有益的組分，如氨基酸、糖、維生素C、微量元素、多酚等，其中多酚類物質具有較高的抗氧化活性，可清除自由基，預防疾病[2-4]，且與橙汁混濁密切相關，直接影響橙汁的口感及色澤[5]，因此，濃縮還原橙汁中多酚含量的研究具有重要意義。目前總酚含量的測量方法有化學發光反應法[6]、2，2-聯苯-1-三硝基苯肼（DPPH）測定法[7]、福林（Folin-Ciocalteu）法、FRAP法（Fe3+還原法）[8]、液相色譜法[9-10]等，其中Folin-Ciocalteu法具有操作方便、所用試劑價格低廉、適用于批量檢測等優點。但是目前沒有采用 Folin-Ciocalteu 法測定濃縮還原橙汁中多酚含量的標準方法，相應研究報道也較少，本研究旨在優化該法的反應條件并將其用于測定不同地區濃縮還原橙汁中的總酚含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市場購買的不同橙汁主產地[11]的濃縮還原橙汁（商品標簽標注產地分別為巴西、美國、以色列、江西省、四川省、浙江省、天津市、河南省、山東省、廣東省，均標明果汁含量≥100%），儲存于-4 ℃備用;沒食子酸標準品，國藥集團化學試劑有限公司;福林試劑，上海荔達生物科技有限公司;牛血清蛋白質標樣，賽默飛世爾科技有限公司;TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司;AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;ABBE-3L折光儀，美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃縮還原橙汁果汁含量的測定 按GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》測定購買的橙汁果汁含量。結果表明，濃縮還原橙汁的果汁含量測定值與標簽標注值相符。

1.2.2 比色條件的選擇 配制一系列濃度梯度（0.10、015、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L）的福林試劑及質量分數梯度（7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%、20.0%）的Na2CO3溶液。吸取0.5 mL巴西產濃縮還原橙汁至50 mL比色管中，加入25 mL蒸餾水，搖勻，再加入5 mL一定濃度的福林試劑、10 mL一定質量分數的Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至50 mL，分別在一定溫度梯度（20、40、60 ℃）下反應，測定不同反應時間（10、20、40、60、80 min）下在760 nm處的吸光度。

1.2.3 福林試劑最優濃度的選擇 取巴西產濃縮還原橙汁0.5 mL，Na2CO3溶液的質量分數為12.5%，恒溫水浴溫度為60 ℃，反應時間20 min，取 5 mL不同濃度（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L）的福林試劑，按“1.2.2”節的試驗方法，測定體系在760nm處的吸光度。

1.2.4 Na2CO3溶液質量濃度的選擇 取巴西產濃縮還原橙汁0.5mL，福林試劑的濃度為0.25 mol/L，恒溫水浴溫度為 60 ℃，反應時間20 min，取10 mL不同質量分數（7.5%、100%、12.5%、15.0%、17.5%、20.0%）的Na2CO3溶液，按“122”節的試驗方法，測定體系在760nm處的吸光度。

1.2.5 反應時間、反應溫度的選擇 取巴西產濃縮還原橙汁0.5 mL，福林試劑的濃度為0.25 mol/L，Na2CO3溶液的質量分數為12.5%，改變溫度梯度及反應時間，在760nm處測定吸光度。

1.2.6 標準曲線的建立 分別準確移取0、1、2、3、4、5、6 mL濃度為100 μg/mL的沒食子酸標準溶液于50 mL比色管中，制得濃度分別為0、2、4、6、8、10、12 μg/mL的系列標準溶液，各加入25 mL的水、5 mL 0.25 mol/L的福林試劑，充分搖勻后，各加入10 mL 12.5%的碳酸鈉溶液，定容，60 ℃水浴 20 min，760 nm波長下比色，以總酚含量（以沒食子酸計）為橫坐標、吸光度（D760 nm）為縱坐標，建立標準曲線。endprint

1.2.7 精密度試驗 室溫條件下，準確移取6份3.0 mL沒食子酸標準溶液，按照“1.2.2”節的方法測定總酚含量，計算RSD值。

1.2.8 穩定性試驗 室溫條件下，取同一濃縮還原橙汁 0.5 mL 至50 mL比色管中，加入25 mL的水、5 mL 0.25 mol/L的福林試劑、10 mL 12.5%碳酸鈉溶液，混合均勻后定容至50 mL，60 ℃水浴20 min，分別在反應時間為30、60、90、120、150、180 min時于760 nm處測定其對應總酚含量，并計算RSD值。

1.2.9 加標回收率試驗 室溫下取0.5 mL巴西產濃縮還原橙汁至50 mL比色管中，按照“1.2.2”節的方法測定其總酚含量作為本底量;再分別移取0.5 mL同一濃縮還原橙汁至3個比色管中，各加入0.5、1.0、1.5 mL的100 μg/mL標準溶液后按照“1.2.2”節的方法測定總酚含量，并計算回收率。

1.2.10 樣品總酚含量的測定 在選擇出最優比色條件后，分別準確移取0.5 mL的樣品溶液至50 mL比色管中，按“122”節的方法測定不同產地濃縮還原橙汁的總酚含量。

2 結果與分析

2.1 比色條件的選擇

2.1.1 福林試劑最優濃度的選擇 由圖1可得，在0.10～0.40 mol/L內，隨福林試劑濃度增大，D760 nm逐漸增大。在濃度小于0.25 mol/L時D760 nm增加顯著;在濃度大于 0.25 mol/L 時，D760 nm變化較小且趨于平衡。因此，按照“反應靈敏度高、節約試劑”的原則，選擇0.25 mol/L的福林試劑。

2.1.2 Na2CO3溶液質量分數的選擇 由圖2可知，碳酸鈉溶液的質量分數為7.5%～12.5%范圍內，隨著碳酸鈉濃度的增大，吸光度隨著增加;當碳酸鈉溶液的質量分數大于125%時，隨碳酸鈉溶液質量分數的增大，吸光度減小。因此選用12.5%的碳酸鈉溶液。

2.1.3 反應時間、反應溫度的選擇 由圖3可得，反應溫度為20、40、60 ℃，反應時間分別為60、40、20 min時，D760 nm達到平衡，D760 nm分別為0.613 2、0.612 7、0.617 4。按照“靈敏度高、反應時間短”的原則，選擇反應溫度為60 ℃，反應時間為20 min。

2.2 方法學評價

2.2.1 標準曲線的建立 結果表明，在0～12 μg/mL濃度范圍內，沒食子酸的含量與D760 nm線性關系良好，回歸方程為y=0.069 4x-0.004 3（r2=0.998 9）。建立標準曲線如圖4所示。

2.2.2 精密度試驗 精密度試驗結果表明，總酚吸光度的RSD為1.09%。

2.2.3 穩定性試驗 不同反應時間下的RSD值為2.02%，表明穩定性好。

2.2.4 加標回收率試驗 加標回收率試驗結果見表1。

表1 加標回收率結果

序號 本底量

（μg） 加標量

（μg） 測定的總量

（μg） 回收率

（%）

1 445.14 50 495.29 100.3

2 444.58 50 493.63 98.1

3 443.15 50 493.00 99.7

1～3平均〖5〗99.4

4 444.49 100 546.99 102.5

5 442.99 100 545.79 102.8

6 445.03 100 546.53 101.5

4～6平均〖5〗102.3

7 445.55 150 594.65 99.4

8 446.77 150 596.02 99.5

9 446.09 150 594.74 99.1

7～9平均〖5〗99.3

2.2.5 干擾試驗 采用福林試劑測定橙汁多酚時，橙汁中的本底蛋白質含量可能會產生干擾，根據相關文獻報道，橙汁中蛋白質含量約為82 μg/mL[12]，取0.5 mL 100 μg/mL牛血清蛋白質溶液，按“1.2.2”節方法測得760 nm處的D760 nm為0019;同樣條件下，橙汁中總酚的D760 nm大于0.5，因此蛋白質的影響可以忽略。

2.2.6 濃縮還原橙汁中總酚含量的測定 由圖5可知，不同地區商品濃縮還原橙汁總酚含量相差較大，介于571.80～1 101.33 μg/mL。

3 結論

本研究采用Folin-Ciocalteu法測定濃縮還原橙汁中總酚含量，確定了反應的最佳條件，該方法具有穩定性好、精密度高、操作簡便、省時、不受蛋白質的干擾等優點，為濃縮還原橙汁中總酚含量的研究提供技術支持。對不同產地商品濃縮還原橙汁中總酚含量的測定發現，總酚含量相差很大，為濃縮還原橙汁的飲用價值研究提供了理論依據。

致謝：感謝莫衛民老師及陳小珍老師在論文選題方面給予的指導，張慧博士在論文寫作方面給予的意見，以及王展華、裴華2位同事在試驗過程中給予的幫助。

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