1株高效降解偶氮染料菌株的篩選與鑒定

馮瑋+石海英+徐偉+柳仁民

摘要：從山東聊城某印染廠污水處理池的活性污泥中篩選出1株能高效降解偶氮染料莧菜紅的菌株ts1-2，從生理生化特性和16S rDNA序列2個方面對該菌株進行鑒定，初步鑒定為駒形白色桿菌（Leucobacter komagata）。在靜置培養條件下對該菌株的脫色反應進行研究，結果表明，ts1-2菌株在染料初始濃度50 mg/L時有最佳脫色率，染料最大脫色濃度為1 250 mg /L。在最適脫色條件下脫色14 h，染料脫色率可達到95%以上。

關鍵詞：偶氮染料;莧菜紅;16s rDNA;脫色率

中圖分類號： X703;Q939.9 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0352-03

收稿日期：2014-04-21

基金項目：國家自然科學基金（編號：31170110）。

作者簡介：馮 瑋（1984—），女，山東聊城人，碩士研究生，講師，主要從事資源微生物研究。E-mail：fengwei01@lcu.edu.cn。

通信作者：柳仁民，博士，教授，主要從事分析化學研究。E-mail：liurenmin@lcu.edu.cn。

偶氮染料是一類在生產中廣泛使用的染料，它具有色調范圍廣、色牢度高、合成成本低等優點，可用于紡織、皮制品的染色及印花等。在紡織工業中使用的偶氮染料約占染料總量的70%[1]。

染料廢水是較難處理的工業廢水。廢水中的染料不僅是原料的損失，也會污染環境，阻礙水體自身的凈化，對水生植物和魚類有毒害作用。水中的染料吸收了太陽光，削弱了光在水中的透射，從而抑制了水體中水生植物的光合作用，影響其生長，進而影響到整個食物鏈，使水生生態系統的多樣性下降[2]，所以顏色的去除是處理染料廢水所面臨的一個重要問題。此外，從染料的結構、性質和特點可以判斷，大多數染料都具有潛在的毒性[3-4]。這就要求染料廢水在排放入環境前必須處理。

本試驗以偶氮染料莧菜紅為降解對象，篩選能夠高效降解此染料的菌種。細菌脫色偶氮染料的機理是產生能降解偶氮染料的偶氮還原酶，本研究還探討了該菌株的產酶方式，為下一步優化產酶條件研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣 菌種采自山東聊城某印染廠污水處理車間厭氧污泥。

1.1.2 培養基 富集培養基：牛肉膏1 g，酵母膏1 g，蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL;pH值7.0±0.2。脫色培養基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.1.3 偶氮染料 莧菜紅（amaranth），化學式見圖1。無特殊說明情況下，莧菜紅染料均為50 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 脫色菌株篩選 將印染廠污水處理車間采集的污泥制成懸濁液，取上清液加入到活化富集培養基中富集，再轉移到以偶氮染料為唯一碳源的培養基中馴化，馴化采用一次性投加高濃度化合物的馴化方法，每個馴化周期結束時，取一定體積培養基加入到新鮮的唯一碳源培養基中，并不斷提高培養基中偶氮染料的含量，經過多次馴化后，反復進行平板涂布，分離出對偶氮染料有高效降解能力的菌株。

1.2.2 菌種鑒定 （1）形態學觀察：將脫色菌株在細菌生長固體培養基平板上培養24 h，經革蘭氏染色后，用顯微鏡觀察細胞形態。 （2）生理生化特征：參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》及參考文獻[5]進行鑒定。 （3）16S rRNA基因序列分析：采用 UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株DNA。應用16S rRNA兩端保守區域設計引物——正向引物7F （5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和反向引物1540R （5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）進行PCR擴增。擴增反應體系模板 （基因組 DNA 20～50 ng/μL） 0.5 μL，5× buffer 2.5 μL，dNTPs （各 2.5 mmol/L） 1 μL，7F primer 0.5 μL，1540R primer 0.5 μL，補加 ddH2O 至 25 μL。擴增反應條件為 97 ℃ 3 min;97 ℃ 25 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 1 min，30 個循環;72 ℃ 10 min。PCR 產物用 1%瓊脂糖電泳檢測。PCR 得到的擴增產物送交給生工生物工程（上海）股份有限公司測序，得到的 16S rRNA 核苷酸序列登陸 NCBI，輸入GenBank 數據庫進行BLAST比對，獲取與其核酸序列相似度高的菌種。采用MEGA 5.0軟件進行多序列匹配比對，計算相似序列之間的進化距離，利用 Neighbor-Joining 構建系統發育樹。

1.2.3 產酶模式研究 測定細菌生產曲線，同時測定菌株對染料的脫色率和最大脫色濃度。將菌種接入到未加染料的LB培養基中，37 ℃靜置培養過夜，將培養液按體積分數2%的量加入到染料培養基中進行脫色試驗。培養液在 8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液在染料的最大吸收峰520 nm處測其吸光度，按照公式計算脫色率：

脫色率=D0-DtD0×100%。

式中：D0為加入細菌前染料的吸光度，Dt為加入細菌t時間后染料的吸光度。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

2.1.1 形態學觀察 經過分離篩選，并比較24 h內的脫色效率，得到1株能高效降解莧菜紅偶氮染料的菌株ts1-2。當染料濃度為50 mg/L時，菌株ts1-2能在14 h內降解95%染料，最大脫色濃度為1 250 mg/L（圖2）。經觀察菌株在平板培養基上菌落為圓形，邊緣整齊，白色或乳白色，鏡檢為革蘭氏陽性，桿狀，不運動。endprint

2.1.2 生理生化特征。菌株ts1-2部分生理生化特征見表1。

表1 菌株ts1-2部分生理生化特征

生理生化試驗 生理生化

特征 生理生化試驗 生理生化

特征

淀粉水解 - V. P. 反應 -

七葉苷水解 - 利用有機酸

脲酶 + 乙酸 +

硫化氫產生 + 草酸 +

吲哚產生 - 檸檬酸 -

硝酸鹽還原 - 乳酸 +

甲基紅試驗 + 琥珀酸 +

〖3〗 馬脲酸 +

2.1.3 16S rRNA基因序列分析 將擴增得到的16S rRNA 基因電泳檢測，測得其序列長度為1 405 bp。經 BLASTn 軟件序列分析，結果表明ts1-2與駒形白色桿菌（Leucobacter komagatae）聚為一簇，同源性最高。從GenBank中調取與細菌ts1-2同源性較高的15株菌株的16S rRNA 基因序列構建系統發育樹見圖3。結果顯示，ts1-2與L.komagatae種相似度最高達99%。根據菌株的形態學特征、生理生化特征和16S rRNA 基因序列分析，初步確認ts1-2菌為駒形白色桿菌。

2.2 產酶模式研究

將菌株在37 ℃條件下靜置培養測定其生長曲線，發現細菌ts1-2在4～14 h內為對數生長期，14～60 h內為平衡期，60 h后進入衰亡期（圖4）。

細菌能夠使偶氮染料褪色，是因為菌體產生了能夠降解偶氮染料的偶氮還原酶[6]。Hu等證明，細菌分泌的偶氮還原酶為一種誘導酶而不是固有酶[7]。在培養基中加入染料作為誘導物，菌體則會產生偶氮還原酶。測定細菌ts1-2生長24 h內脫色率，結果如圖5所示。

菌體進入對數生長期時，菌體的脫色效率成指數增長，表明菌體內的偶氮還原酶隨菌體增多而增多。當菌體生長進入平衡期后，菌體數量不再增加，重復加入染料后發現菌體仍有脫色能力，但脫色速率變小，說明能夠還原染料的酶雖然保持一定活性但是沒有新的酶產生，這種酶的合成方式應為同步合成型。

3 結論

紡織廢水由于所含染料具有色度高、化學結構穩定以及

難于被降解等特點，成為目前最難處理和最受關注的廢水之一。偶氮染料在紡織染料中所占的比例最高，超過了70%。目前處理染料廢水的物理和化學方法具有處理成本高、處理不徹底并且容易造成二次污染等缺點[8]。因此，篩選高效降解偶氮染料的微生物，將其應用于染料廢水處理具有深遠的意義，并且逐漸成為研究的熱點之一。

本試驗從印染廠染料廢水處理反應池的活性污泥中，篩選分離出1株能使偶氮染料莧菜紅脫色的菌株ts1-2。從形態學特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列比對3個方面對菌株進行鑒定，確定其為駒形白色桿菌（L. komagatae）。

Suzuki 等從紡織廠污水處理裝置附近土壤中得到1株能夠還原偶氮染料的芽孢桿菌OY1-2[9]。Wong 等從染料廢水污泥中分離出能夠在好氧條件下將甲基紅脫色的細菌肺炎克雷伯氏菌RS-13[10]。Hu等發現的菌株Pseudomonas luteola在完全靜止或完全振蕩的條件下均不降解染料，但在 2 d振蕩加 2 d靜止的條件下對染料的脫色效果顯著[11]。本次分離得到的菌株ts1-2僅在靜置培養14 h就能使 50 mg/L 濃度染料脫色95%以上，培養條件簡單，脫色效率高。本試驗還發現此菌株的產酶方式為同步合成型，為進一步優化菌株產酶條件的工作奠定了基礎。

參考文獻：

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[11]Hu T L. Decolourization of reactive azo dyes by transformation with Pseudomonas luteola[J]. Biosource Technology，1994，49：47-51.endprint