典型消毒劑及與紫外聯合與再生水消毒副產物生物毒性效應的關系

熊張東+唐文浩+唐天樂+白娟娟+余芬芳

摘要：用次氯酸鈉、二氧化氯、氯胺、臭氧等4種典型消毒劑及與紫外聯合消毒處理沉淀池出水，以模式生物斑馬魚的胚胎為研究模型，對斑馬魚胚胎進行暴露試驗，以心率、成活率、孵化率、畸形率來表征生物毒性和生態毒理效應，研究分析各典型消毒劑及與紫外聯合消毒對胚胎發育的影響。結果表明，各種消毒劑消毒后的水樣均對斑馬魚胚胎有減緩心跳和致畸作用，無明顯的致死性;紫外聯合方式優于單一消毒;二氧化氯消毒致畸性最弱，次氯酸鈉和氯胺消毒對胚胎有一定影響，臭氧消毒生態安全性存在很大問題。

關鍵詞：消毒劑;紫外聯合消毒;胚胎發育;毒理效應;再生水

中圖分類號： X131.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0363-03

收稿日期：2014-12-18

基金項目：國家“863計劃”（編號：2013AA102802）;國家科技支撐計劃（編號：2012BAC18B04）。

作者簡介：熊張東，男，安徽安慶人，碩士，從事環境工程水處理研究。E-mail：xzd8256863@126.com。

次氯酸鈉、二氧化氯、氯胺是典型的含氯消毒劑，臭氧有著強氧化性和二次污染小的特性，均為目前最常用的典型消毒劑[1]，在再生水的回用處理中應用廣泛，這4種消毒劑在殺滅細菌的同時，會與污水中前提有機物發生取代反應，形成不同種類的DBPs，其中，次氯酸鈉消毒副產物主要有三氯甲烷（THMs）和鹵代乙酸（HAAs）;二氧化氯與前驅物發生氧化還原反應，生成ClO2-和ClO3-等致癌產物;氯胺主要依靠一氯胺和二氯胺的氧化性消毒，其副產物與次氯酸鈉類似，由于不是游離氯，使得副產物含量降低;臭氧消毒副產物較少，當水樣中含有Br-時會產生溴酸鹽。紫外消毒法主要利用紫外線破壞細胞DNA達到滅菌的效果，操作簡便、消毒副產物少，正逐步代替氯消毒工藝[2]。

斑馬魚為熱帶淡水魚，成長周期短，實驗室條件飼養方便、易于操作，體型較小，身體上斑馬紋線條間隔，胚胎透明度較大，易于觀察內部結構的分化過程，并且作為魚類生物鏈的高級群體，其生態毒理效應能直觀反映水環境的情況，是非常典型胚胎發育研究的模式生物，作為胚胎發育生物學和遺傳學的試驗動物，被廣泛運用于早期胚胎發育基因表達控制研究，后被用于化學混合物的急、慢性毒性檢測及重金屬生物累積效應研究等[3]。 目前，城市污水成分復雜，有害物質種類多、濃度低，消毒劑消毒的同時會伴隨消毒副產物的產生，已知的副產物種類就有幾百種，采用化學分析方法成本高，對已知的副產物分析不全面，未知成分也無法定量分析，不能真實有效地反映其環境危害性，而采用生物方法則具有明顯優勢，可從毒理學的響應反映其生態安全性。本試驗以斑馬魚胚胎作為模式生物，采用污水廠進行實際水樣模擬，研究4種典型消毒劑及聯合紫外消毒與再生水消毒副產物生態毒理效應的關系，通過分析比較來評價所采用技術方法的生態安全性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 水樣預處理 采集海南省?？谑忻捞m區白沙門某污水處理廠的沉淀池出水及紫外消毒后的出水，混凝處理取上清液，用0.45 μm濾膜抽濾，得到含有復合溶解性有機物的水樣，低溫保存備用。水樣均在使用前取得，保存時間不超過1周，以防止溶解性有機物因外界條件變化不穩定造成誤差。

1.1.2 消毒劑 次氯酸鈉0.3 mg/L，原試劑活性氯≥55%，使用前標定;氯胺1 mg/L，原試劑活性氯≥24.0%，試劑為氯胺T，分子式為C7H7ClNNaO2S·3H2O;二氧化氯2.4 mg/L，原試劑含量99%，分析純;臭氧發生器制備臭氧 20 mg/L，5 g/h消毒時間30 s;紫外劑量為白沙門某污水處理廠標準處理劑量，≥300 J/m2。試驗過程均采用超純水以排除其他雜質干擾，含氯消毒劑棕色試劑瓶貯存，低溫保存。參照文獻[4-8]配制不同濃度梯度的消毒劑，對消毒后水樣微生物和余氯量進行測定，均以加入水樣后有效氯計;聯合紫外消毒試驗各消毒劑的量不變，臭氧消毒濃度按照儀器的制備規格確定消毒時間。

1.1.3 斑馬魚胚胎的培養 在實驗室條件下，從幼魚階段開始飼養斑馬魚，魚缸采用惰性塑料及鋼化玻璃材質。為保證魚體本身不受外界條件污染，飼養用水為曝氣水（自來水經過曝氣光照去除氯），溫度恒定為26 ℃左右，pH值保持為8左右，以飼料和幼蟲為食物喂養2～3個月;嚴格按照光照比 14 ∶ 10 誘導產卵;收集魚卵，用超純水清洗去除雜物。由于長期試驗用魚卵質量會有所下降，成活率降低，需要經過12 h的自身發育來進行篩選，正常胚胎呈透明狀，觀察剔除胚胎出現明顯白斑、卵核出現凝結等本身發育不良的胚胎。

1.1.4 試劑和儀器 次氯酸鈉、二氧化氯、氯胺、臭氧發生器;棕色試劑瓶、移液管若干、移液槍（一次性槍頭）、8×6的孔板;熒光電子顯微鏡、恒溫培養箱等。

1.2 試驗過程

試驗水樣共9組，沉淀池出水及紫外消毒出水的預處理水樣分別加4種消毒劑進行消毒，以曝氣水作為空白對照。用移液槍吸取選取的魚卵至孔板內，每孔1粒，共48粒;盡量吸盡培養魚卵的用水，以減小試驗誤差;每個孔板加1種消毒劑消毒水樣，放置恒溫培養箱中27 ℃培養，每隔24 h依次取出魚卵于熒光電子顯微鏡下觀察1次所有魚卵的發育成活情況，記錄試驗數據和現象。每次觀察完畢，更換孔板水樣以保持魚卵暴露狀態的持續性。

1.3 統計分析

1.3.1 特征觀察 根據斑馬魚胚胎發育的時間進行觀察（表1）。細胞分化初期，無心跳特征，未到達孵化時間，畸形特征還不能觀察;48 h記錄未孵化胚胎心跳，72 h記錄孵化后心跳，48 h已經孵化和72 h未孵化的不計入觀察。

表1 各個時間段魚卵的觀察要求

染毒時間endprint

（h）

魚卵特征

心跳 孵化率 致畸率 成活率

24 - √ - √

48 ▲ √ √ √

72 ▲ √ √ √

注：-，不能觀察;√，可觀察;▲，部分觀察。

1.3.2 數據統計 心率比值=染毒胚胎心跳次數/空白正常胚胎心跳次數;孵化率=孵化胚胎數量/當前孔板總孔數×100%;成活率=成活數量/當前孔板總孔數×100%;致畸率=致畸數量/當前孔板總孔數×100%。采用系統取樣法選取試驗數據。

2 結果與分析

2.1 毒理學特征表現

試驗魚卵成活率為100%，未出現死亡。消毒劑處理過的水樣會使斑馬魚胚胎發育延緩，同等時間下細胞分化速度降低，無卵凝結出現，未完全孵化及孵化后的胚胎都出現心胞囊腫，造成部分魚卵發育畸形，孵化完全的斑馬魚出現脊柱彎曲、卷尾（圖1、圖2）。根據OECD制定的《關于斑馬魚胚胎檢測單一化學毒性詳細指南》，本試驗斑馬魚胚胎均為Ⅱ類非致死形態學指標，無卵凝結、心跳停止等致死性類型[9]。

2.2 消毒劑及與紫外聯合對斑馬魚心率比值的影響

心率比值越大，試驗斑馬魚的胚胎心跳越接近正常水平。由圖3可見，紫外聯合4種消毒劑消毒相比單一消毒，心率比值都有所增加;二氧化氯消毒副產物對胚胎心跳的影響相對最小，臭氧消毒副產物對斑馬魚胚胎的心跳降低最為明顯。由此可推斷：二氧化氯相比其他2種含氯消毒劑，以ClO-2和ClO-3 為主要致癌物質的副產物對斑馬魚胚胎發育過程心跳

的影響較大，在完全孵化后則不及THMs和鹵代乙酸HAAs對魚體心跳的影響;臭氧消毒副產物對孵化出的斑馬魚心跳影響更大，當臭氧消毒方式與水樣接觸時，可能會產生更多量的THMs和鹵代乙酸HAAs，目前對臭氧消毒產生副產物的研究還不充分[10]。

2.3 消毒劑及與紫外聯合對斑馬魚孵化率的影響

由圖4、圖5可見，各種消毒方式均對胚胎的發育有延緩作用，但無發育停止現象;不同單一消毒劑影響斑馬魚胚胎發育的時間不同，臭氧消毒水樣染毒48 h的斑馬魚胚胎孵化率相對最高，為29.17%，以氯胺組水樣染毒72 h的斑馬魚胚胎孵化率相對最高，但基本無影響，可達到正常發育水平;紫外聯合各消毒劑，48、72 h基本趨勢不變，紫外聯合含氯消毒劑進行消毒，對斑馬魚胚胎孵化率的影響減小，與不同消毒劑副產物的生成機制相吻合。這是因為影響紫外消毒的是水質透明度，劑量變化讓滅菌效果出現峰值，紫外聯合氯消毒不僅能

提高再生水滅菌效果，更能在部分種類上減少THMs等副產物的量[11]。二氧化氯消毒產物對斑馬魚胚胎發育的延緩最明顯，氯胺和次氯酸鈉影響較小。

2.4 消毒劑及與紫外聯合對斑馬魚畸形率的影響

由圖6、圖7可見，不同消毒水樣對斑馬魚胚胎均有致畸

性影響，單一消毒和紫外聯合消毒均以臭氧組水樣致畸性最為明顯，二氧化氯的影響最小，次氯酸鈉和氯胺次之;消毒劑二氧化氯有效氯2.4 mg/L達到消毒效果的同時，得到的副產物致畸性相對最小，生態安全性最高;4種消毒劑聯合紫外消毒，次氯酸鈉和氯胺的致畸性明顯降低，這與紫外聯合消毒控制再生水消毒副產物的機制相符;臭氧消毒致畸性在單一消毒和紫外聯合消毒均有很強的致畸性，這可能是由于臭氧氧化水樣中的有機物，生成少量消毒副產物，同時，污水水樣本身可能含有Br-，臭氧條件下溴化物轉化為次溴酸鹽，繼而生成溴酸鹽和溴代有機物，而溴酸鹽可以導致染色體變異和DNA損傷，且具有一定的遺傳毒性[10，12]。

3 結論與討論

次氯酸鈉0.3 mg/L、氯胺1 mg/L、二氧化氯2.4 mg/L、臭氧消毒時間30 s這4種典型的消毒劑及與紫外聯合消毒，對再生水都有一定的生物毒性作用，表現在試驗斑馬魚心率減緩、有較高的致畸性和發育受到抑制，無明顯的致死現象，存在一定的生態安全風險。

紫外聯合消毒效果明顯優于單一消毒方式，水處理消毒環節可以考慮聯合紫外消毒方式，優化出水水質，降低對環境安全的影響。二氧化氯消毒水樣染毒胚胎的孵化率相對較高，致畸率較低，并且胚胎染毒對形態發育完全的斑馬魚心率影響最小;有研究表明，二氧化氯聯合液氯消毒相比單一消毒更能降低副產物的產生[13]。因此，從生態毒理效應方面評價，二氧化氯是較為有前景的消毒劑，可聯合紫外或者液氯消毒劑應用于消毒工藝。臭氧消毒目前大多數認定副產物較少，但有研究表明，其仍然會產生THMs和鹵代乙酸HAAs，會有致癌物質溴酸鹽產生，在實際應用中還存在一定生態安全風險，需要做進一步研究。

針對污水處理廠的出水，目前普遍使用各種消毒劑后BOD、COD、重金屬離子及特定物質等重要指標都能夠達標，但由于一些微量、痕量污染物的指標體系不完善，具體檢測方法也無法全面系統、逐一實施，仍存在生態安全風險。生物學檢測可以從毒理學角度考量污水的生態安全性，科學模擬污水排放后對環境的影響，進行進一步研究，可以為污水的消毒工藝提供更加科學有力的理論基礎。

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