DNA甲基化對植物生長發育的調控研究

孟彩鳳　周穎

摘 要：DNA甲基化修飾在表觀遺傳中占據重要的位置，DNA甲基化會改變啟動子調節區域的功能狀態，但不會改變胞嘧啶堿基序列。在植物中DNA甲基化發生在C的任何序列上：CG，CHG及CHH（H=A，T或者C）。植物中的DNA甲基轉移酶主要分為3類，染色質甲基化酶（CMT）、甲基轉移酶I（MET I）和結構域重排甲基轉移酶（DRM）。DNA甲基化主要通過調控基因的表達，如植物轉座子的沉默，內源基因表達，春化作用，植物防御作用等，進而調節植物的生長發育。

關鍵詞：DNA甲基化；植物；生長發育

中圖分類號 Q7 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）10-29-04

Abstract：DNA methylation plays a dominant role in epigenetic mark.DNA methylation can change the function of regulatory regions without changing the cytosine base paring.In plants，any sequence of cytosine could be mathylated，including the symmetric CG，CHG，and the asymmetric CHH（H=A，T or G）.And there are three kinds of DNA methyltransferases in plants：Chromomethlase（CMT），DNA METHYLTRANSFERASE 1（MET1），DOMAINSREARRANGED METHYLTRANSFERASE（DRM）.DNA methylation regulates the growth and development of plants through regulating gene expression，transposon silencing，endogenous gene expression，vernalization，plant defense and so on.

Key words：DNA methylation；Plant；The growth and development

1 表觀遺傳學與表觀基因組

公元前3世紀，古希臘哲學家Aristoteles在《論動物生成》中提出了相對于先成論（pre-formation）的后成理論（epigenesis），他認為新器官是由未分化的團塊發育形成的。1939年，發育生物學家Conrad Waddington根據希臘詞epigenesis正式提出表觀遺傳學的定義，他指出表觀遺傳主要是研究基因型（genotype）產生表型（phenotype）的過程，1942年他提出基因與表型之間存在一種因果機制，將這種控制機制定義為表觀遺傳學，并將表觀遺傳學列為生物學的一個分支。1975年，生物學家Robin Holliday比較系統的概括了表觀遺傳學的定義，即表觀遺傳學是研究在DNA序列不發生改變的情況下，引起基因表型改變，并且通過有絲分裂、減數分裂等遺傳方式能夠在細胞與個體間傳遞，這種傳遞不遵循孟德爾遺傳規律的。經過近80a的演變，逐漸形成了我們今天對表觀遺傳的定義：在DNA序列不發生改變的情況下，全基因組范圍內使表型能夠穩定遺傳的修飾機制[1]。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化修飾，ATP依賴的染色質重塑，組蛋白共價修飾，組蛋白變體和非編碼RNA編輯。眾所周知，在許多真核生物中，基因組的活動是由組蛋白修飾和DNA甲基化來調控的，雖然我們不能忽視染色質的其他修飾（包括H3K27me3）也屬于表觀遺傳的事實[2-3]，但是DNA的甲基化在表觀遺傳中占據了主要的位置，而且DNA甲基化是表觀遺傳標記中最早發現且研究比較透徹的。

DNA甲基化為全基因組DNA提供了一種可逆的分子標記方法。細菌可以將自身基因組中的腺苷酸或者胞嘧啶甲基化，以識別并降解入侵的外來DNA，同時還可以在細胞分裂前追蹤錯配修復和基因組復制的進度[4-5]。在植物和哺乳動物中，DNA甲基化修飾作為可遺傳的表觀遺傳修飾調控基因的表達[6-8]。真核生物DNA的甲基化只發生在胞嘧啶上，而且DNA序列CG中胞嘧啶的甲基化和組蛋白的H3中第9位的賴氨酸（H3K9me3）的三甲基化通常是在細胞分裂時通過DNA半保留復制的方式而獲得的[9-11]。自從這一現象被發現，把在體外甲基化的DNA導入抓蟾卵母細胞[12]或者培養的哺乳動物細胞中[12-13]此DNA的轉錄就會暫停，DNA甲基化就在功能上與抑制基因表達聯系起來了。重要的是，很多生物體中都不存在甲基化，所以甲基化不總是真核生物調控基因表達所必不可少的，這些生物體包括多細胞動物，如雙翅目昆蟲、秀麗隱桿線蟲，這說明在發育過程中的轉錄調節，生物體不一定要DNA甲基化。而在很多進化枝中，DNA甲基化都是必不可少的，其普遍性及其在基因組上分布的廣泛性，表明由于DNA甲基化作用不同其存在模式也不同[14-16]。

2 DNA甲基化對基因表達的抑制機理

DNA甲基化能夠引起DNA的構象、DNA的穩定性、染色質的結構以及DNA與蛋白質之間的相互作用方式的改變，因此其在生物體的生長發育調節、基因表達調控以及基因組印跡等許多方面都有著不可替代的重要作用。

2.1 DNA甲基化直接干擾轉錄因子與啟動子識別序列的結合 DNA分子雙螺旋結構是其特有的特殊結構，而轉錄因子與DNA結合的部位就在DNA雙螺旋的大溝中，能夠被許多蛋白質轉錄因子所識別并結合的啟動子序列也都會突出于大溝內，這些可被轉錄因子識別的序列中含有CpG位點[17]，當CpG位點的胞嘧啶被甲基化之后，諸如AP-2（堿性磷酸酶）、E2F（轉錄因子）、NF-κB（反式作用因子）、CAREB（周期性AMP依賴的啟動因子）等在內的許多對DNA甲基化位點敏感的轉錄因子就會不再和相應的啟動子序列結合，這就導致了相應基因的轉錄無法啟動，進而導致相應基因不能表達。但是還有一些例如SP1、CTF等等在內的轉錄因子對CpG二核苷酸胞嘧啶的甲基化并不敏感，因此這些轉錄因子所調節的基因的表達也就不會受到甲基化的影響[18]。

2.2 特異的轉錄抑制物——甲基CpG結合蛋白與CpG的結合 當轉錄因子中的啟動子識別序列中含有被甲基化的CpG序列時，特異的轉錄抑制物即甲基CpG結合蛋白（methyl-CpG bingding protein，MBP）就會與相應的轉錄因子競爭該甲基化序列上的相應結合位點，進而也就導致了相應基因的轉錄與表達被抑制。

2.3 DNA甲基化通過改變染色質的結構起到抑制基因轉錄表達的作用 除了上述2種方式之外，DNA甲基化還能夠通過誘導染色質失去活性、阻止相應的轉錄因子進入等方式來起到阻止染色質的活化的作用[19]。目前對于通過DNA甲基化來抑制基因的轉錄表達活性的研究主要是圍繞著基因沉默、DNA的高度甲基化以及結構多變的染色質之間的聯系進行的。在哺乳動物中，DNA甲基化、基因沉默、染色質結構之間存在著某種內在的聯系，這種現象在很多年前就已經被人們所發現。早期的研究顯示，高度甲基化的CpG二核苷酸序列與細胞核內的異染色質的形成有關，而體外的實驗結果表明，DNA甲基化與染色質質凝聚形成染色體有關，其它的研究結果也表明未被甲基化或者低水平甲基化的CpG島大多集中在高度乙?；慕M蛋白上。出現這種機制的原因一直以來都不清楚，最近有研究發現染色質的結構能都調節基因的表達，這個理論有可能能夠證實這種機制。

染色質的構象呈現動態變化，那么其DNA的高度甲基化是否會伴隨著組蛋白的乙?；腿ヒ阴；?？這2個轉錄沉默通路間的相互作用機制是怎樣的？在導致轉錄沉默的眾多機制中，DNA甲基化是否占據主要地位？這許多的疑問還尚未被解開，還需要進一步的研究，這也從側面說明了DNA甲基化領域的復雜性與奇妙性。

3 植物DNA甲基轉移酶

根據DNA甲基轉移酶催化反應的類型，可以將其分為3類：第1種類型的DNA甲基轉移酶可以將腺嘌呤轉變為N6-甲基腺嘌呤；第2種類型則能將胞嘧啶轉變為N4-甲基胞嘧啶；第3種DNA甲基轉移酶催化的是最常見的DNA甲基化類型，就是將胞嘧啶轉變成為C5-甲基胞嘧啶。在原核生物中，這3種類型的DNA甲基轉移酶均可見到，它們主要參與了原核生物的限制-修飾系統、調節其DNA的復制和抗噬菌體感染的“免疫應答”。而在高等真核生物中，則只發現有第3種類型的DNA甲基轉移酶的存在，即DNA C5胞嘧啶甲基轉移酶。DNA C5胞嘧啶甲基轉移酶以S-腺苷-L-甲硫氨酸為甲基的供體，將甲基基團轉移到胞嘧啶的第5位碳原子上以完成DNA甲基化的全過程。根據其功能，DNA C5胞嘧啶甲基轉移酶又可分成以下2類：一類是維持DNA甲基化的甲基轉移酶，這種類型的DNA甲基轉移酶主要是在DNA進行半保留復制的時候，根據親本鏈上特異的被甲基化修飾的位點，在新生成的新生鏈的相應位置上也進行同樣的甲基化修飾，這樣就使得在生物一代代遺傳的過程中，母體DNA甲基化的信息不會丟失，保證了生物體的穩定性；另一類是DNA重頭甲基化轉移酶，這種類型的酶主要是在生物體發育過程中使去甲基化的CpG位點重新再甲基化。

截至目前，在植物中發現的DNA甲基轉移酶主要有3種，分別是：染色質甲基化酶（CMT）、甲基轉移酶I（MET I）和結構域重排甲基轉移酶（DRM），這3種DNA甲基轉移酶在胞嘧啶不同的DNA序列中的活性是不同的。

3.1 染色質甲基化酶（Chromomethylase，CMT） CMT甲基轉移酶在植物中分布十分廣泛，它主要是對異染色質DNA進行甲基化修飾。主要作用機理是一個染色質功能域插入在甲基轉移酶保守的Ⅱ和Ⅳ亞基之間，這個功能域可以指導一些在DNA甲基化過程中也發揮作用的蛋白到異染色質區域，然后由CMT甲基轉移酶催化對異染色質DNA進行甲基化修飾。在擬南芥中，已經發現至少有3個基因編碼CMT蛋白，在玉米和十字花科中也發現了2個基因[20-21]。研究發現，CMT3功能的缺失并不能使植物的正常生長發育和生理產生異常，這與另外2種DNA甲基轉移酶的突變體不同。

3.2 甲基轉移酶I（Methyltransferase I，METI） Finnegan等利用催化結構的高度保守性，從擬南芥中分離得到了第一個植物DNA甲基轉移酶MetI的基因，MetI在結構上與哺乳動物的DNA甲基轉移酶Dnmt 1十分類似。MetI家族是植物中最重要的一種DNA甲基化酶，在植物DNA甲基轉移酶中占有統治地位。它主要的作用是維持重復的和單拷貝的DNA序列的甲基化修飾[22]，從而將親代DNA序列相應位點甲基化通過DNA復制傳遞給子代，以保證生物的穩定性，除此之外MetI也很可能在重頭甲基化中起作用。MetI起作用的目的DNA大多是CG序列，除了擬南芥外，在豌豆、番茄、胡蘿卜和玉米中也已經找到MetI的同源物。

3.3 重新甲基轉移酶（domain rearanged methylase，DRM） DRM的結構與Dnmt3十分類似，特異性指導在CNG和CHH（H為除G以外的任何堿基）非對稱位點處的DNA序列發生甲基化修飾。DRM家族包括有DRM1、DRM2和DRM3這3個成員。DRM的N端結構域包括有泛素結合序列，表明了DRM有泛素化潛能。DRM除了可以使非對稱位點的DNA序列從頭甲基化，還能維持失活轉座子以及轉基因沉默位點的胞嘧啶的甲基化[23]。DRM與真菌的作用方式非常相似，它的多突變體可以在2個位點恢復。

除了上述3種DNA甲基轉移酶，在植物中還存在有第4類的DNA甲基轉移酶，也就是擬南芥中的DMT11和玉米種的DMT104，這2種DNA甲基轉移酶很可能是Dnmt2家族的同類物。雖然它們在很多物種中呈現高度的保守性，但是它們的功能目前未研究清楚[24]。

4 DNA甲基化在植物生長發育中的作用

在一些原核生物中，DNA的甲基化修飾可使其形成對自身基因組的保護，以抵御外來基因的干擾。而在植物中DNA的甲基化主要對其基因的表達起到調控作用，進而對植物的生長發育進行調節，另外DNA甲基化還與植物轉基因的沉默有關。

4.1 DNA甲基化是植物正常發育所必需的 研究證實，在植物中DNA甲基化的不足，會使其出現不正常的發育和表型。5-胞苷（5-zaC）是一種去甲基化劑，可以引起基因組DNA甲基化程度的明顯降低，用它處理水稻的種子和甘藍的幼苗發現，成熟植株的基因組DNA甲基化的程度明顯降低，表現出很多生長發育異常性狀，如葉片小、植株矮小[25]等，并且這些特征大多都可以通過遺傳的方式傳遞給下一代。另外，Finnegan[22]和Nakano[26]等人把DNA甲基轉移酶的反義基因即MET1分別轉入野生型煙草和擬南芥中，結果發現這些植株的基因組DNA甲基化水平明顯降低，且營養生長和生殖生長均發生異常，這種不正?，F象的程度與DNA去甲基化的水平呈現正比關系。這些都說明了DNA甲基化對于植物來說是其維持正常的生長發育所必需的，在植物的生長發育以及其它過程中都起著不可替代的關鍵調控作用。

4.2 DNA甲基化與植物的春化作用 春化作用是通過DNA甲基化的改變來發揮作用的。用5-胞苷（5-zaC）對植物進行處理可引起早花，說明基因組DNA甲基化程度的降低對開花起到促進作用，而對春化作用不敏感的植物則對5-胞苷的處理沒有反應，這些都說明春化作用與DNA甲基化是密切相關的。同時，反義構建植物DNA甲基化水平的降低，使其在沒有低溫處理時也促進了開花作用，而且對開花作用的促進作用與基因組DNA甲基化水平的降低程度呈正相關。雖然春化對開花的促進作用機理還不清楚，但其與DNA甲基化的密切聯系為其機理的研究提供了新的思路。

4.3 DNA甲基化可調節植物內源基因的表達 在不同的發育時期以及不同的生長環境下，植物發育的情況是不同的[27]，以適應生存的需要，這主要取決于植物內源基因的選擇性表達，與基因組本身的核苷酸序列無關。植物基因組DNA的甲基化在這個過程中起到了不可替代的調節作用。當基因處于活躍表達的狀態時，DNA甲基化的水平一般較低，然而隨著植物的生長發育需要關閉該基因的表達時，該基因的啟動子或者編碼區就會發生重新甲基化的現象，使其表達受到抑制；相反地，當需要那些表達處于關閉狀態的基因重新活化時，該基因的啟動子區域就會發生去甲基化過程，去甲基化的啟動子對DNaseI有著高度的敏感性，這時基因的轉錄就開始啟動[28]。通過這些機制，植物就可以實現不同發育時期以及不同環境條件下基因的時空表達。

4.4 DNA甲基化對植物基因組防御的作用 在植物基因組中，寄生序列廣泛存在，即一些病毒的殘存序列和轉座子元件等，這些寄生系列的表達會對植物本身基因組的結構和正常有序的基因表達造成破壞。DNA甲基化通過保護自身DNA序列不被自己的DNA限制性內切酶破壞來保護自身基因，又通過對外來DNA序列的切割降解來抵御外來基因組的干擾。同時DNA甲基化通過抑制自身轉座子和外來DNA的轉錄，降低了由于非等位基因之間的轉座和重組引起的對基因組的破壞，既保護了植物自身，又抵御了外來基因的干擾。

5 結語

DNA甲基化是最常見的復制后及轉錄后修飾方式之一，它能夠在不改變基因組序列的前提下，對生物體基因的表達及其功能可逆的可遺傳的改變，DNA甲基化在基因表達調控、基因組印跡、生物體的發育調節等方面都有著重要作用。

DNA甲基化模式在不同時空的變化是生物體正常生長發育所必需的，因此對早期胚胎DNA甲基化模式的研究，對于揭示在生物體早期特異表達的基因以及對其以后生長發育的研究都是很有價值的。在動物中，早期胚胎的整體甲基化程度的變化早已有了很透徹的研究，在其早期胚胎發育過程中DNA甲基化整體水平呈現波動性變化，然而在植物中相關的研究仍非常有限。

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（責編：張宏民）