植物開放式組織培養的研究進展及發展前景

摘要：從抑菌劑種類和濃度、蔗糖濃度、有機物質、培養容器、接種條件及培養方式幾個方面綜述了植物開放式組織培養的發展與應用，并展望了未來發展的前景。

關鍵詞：開放式組織培養;植物;抑菌劑;培養容器;有機物質;接種條件;培養方式

中圖分類號： Q943.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0011-03

收稿日期：2014-05-17

基金項目：江蘇省高校自然科學研究面上項目（編號：13KJB180004）;江蘇開放大學、江蘇城市職業學院“十二五”規劃項目（編號：12SEW-Y-026）。

作者簡介：曾云英（1976—），女，重慶長壽人，碩士，副教授，主要從事園林植物與觀賞園藝、生態規劃方面的研究。E-mail：yuniny@sina.com。

自1902年德國著名植物生理學家和植物學家Haberlandt提出了植物細胞具有全能性的理論之后，植物組織培養作為一種高效的植物快速繁殖技術顯示出了巨大的應用價值。時至今日，植物組織培養技術以其特有的優勢在理論研究和生產應用上不斷被深入改進和創新，各種植物幾乎都有進行組織培養的報道。植物組織培養技術要求嚴格的無菌環境，需要特定的儀器設備（超凈工作臺、高壓滅菌鍋和人工氣候箱），因而生產成本很高，且繁雜的操作程序對工作人員的技術都有一定的要求，這大大地限制了該技術的應用和推廣。為了降低成本，簡化工作程序，學者們一直在努力探索一種能高品質和規?；a試管苗的新技術。隨著研究的不斷深入，“開放式組織培養”理念被提出。植物開放式組織培養是指在抑菌劑的作用下，使植物組織培養脫離嚴格無菌的操作環境，不需高壓滅菌和超凈工作臺，用普通容器代替組培瓶，在自然、開放的有菌環境中進行植物的組織培養[1]。開放式組織培養與傳統的組織培養相比，有成本低、操作環節簡單等優點，因而受到研究者們的喜愛，更是規?；a試管苗的必然趨勢;但由于整個操作過程沒有在無菌的條件下進行，防止污染也成了植物開放式組織培養研究中的主要任務。崔剛等采用中醫理論，從多種植物中提取了具有殺菌、抗菌的活性物質，成功研制出了具有廣譜性殺菌能力的抗菌劑，并利用這一技術成功地建立了葡萄外植體培養體系，同時還開展了多種植物開放式組織培養研究工作[2]。隨后研究者們在多種植物上進行了開放式組織培養的嘗試并取得了成功，主要有香蕉[3-4]、魔芋[5-6]、荸薺[7]、馬鈴薯[8]、梅花[9]、紅豆杉[10]、白菜[11]等植物，已建立開放式組織培養技術體系的植物種類見表1。研究主要集中在抑菌劑種類的選擇和濃度的確定、培養方式以及培養基中有機物質和無機碳這幾方面。本文從抑菌劑、培養方式、培養基成分等方面綜述了植物開放式組織培養的應用現狀及發展前景，以期為該技術的生產應用及推廣提供一定的理論支撐。

表1 植物開放式組織培養的應用

試驗材料 基本培養基 抑菌劑 作者 發表時間

香蕉 MS 次氯酸鈉 莫廷輝等 2011、2012

荸薺 MS 次氯酸鈉 吳桂容等 2013

魔芋 MS H198 趙青華等 2011

梅花 MS 特制消毒液 陳瑞丹等 2007

紅豆杉 MS 山梨酸鉀 王丹等 2010

白菜 B5 大蒜素、代森錳鋅 王趙玉等 2012

馬鈴薯 YEB、PDA YI-1 張薪薪等 2005

葡萄 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

蘋果 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

紅櫨 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

香花槐 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

蝴蝶蘭 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

地被菊 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

1 抑菌劑

在植物開放式組織培養中，由于培養基不經過高溫高壓滅菌，外植體處于開放、自然的有菌環境中，所以能防止污染又不影響外植體生長的抑菌劑就成了研究者們的研究重點?？股厥侵参锝M織培養中用來防止污染的傳統試劑，是組織培養中常用的一種抑菌劑。但其在抑菌的同時有一定的抑菌譜且容易使微生物產生耐藥性，對外植體的分化和生長有一定的影響。王春發現在馬鈴薯培養基中添加20 mg/L的硫酸鏈霉素能完全抑制細菌浸染且對組培苗的生長發育無不良影響[12]。閻志紅等通過實驗發現50 mg/L的青霉素能夠有效地抑制培養基的污染，但長期在含有此濃度青霉素的培養基上繼代培養的西瓜的伸長生長與生根明顯受到抑制[13]。簡興等在紅掌的培養基中加入300 mg/L青霉素與180 mg/L鏈霉素混合液，比單一使用一種抗生素抑菌效果更好[14]。隨后研究者們嘗試使用其他物質作為抑菌劑并獲得了試管苗，報道有農藥（代森錳鋅）、食品添加劑（山梨酸鉀）、家用消毒液（次氯酸鈉）、植物提取物（大蒜素、特制消毒液）等作為抑菌劑。在香蕉的開放式組織培養試驗中，解輝等通過向培養基中添加不同濃度的次氯酸鈉溶液作為抑菌劑，發現0.01%以上濃度的次氯酸鈉可有效抑制培養基的污染，濃度超過002%時外植體的存活率降低，試管苗的生根率低于傳統組培苗[4]?？赡苁怯捎诖温人徕c加入培養基后產生的次氯酸對外植體的生長有一定的影響且使培養基pH值降低影響了外植體對植物生長調節劑的吸收。吳桂容等在荸薺的開放式組織培養試驗中發現當次氯酸鈉濃度為1.0%時的污染率最低，誘導率最高，但都低于對照組[7]。次氯酸鈉穩定性差，易受熱、光和pH值的影響，這可能是導致以上2個試驗所用次氯酸鈉濃度差別大的主要原因。王趙玉等自制生物農藥大蒜素及化學農藥代森錳鋅對白菜種子進行開放式組培，試驗結果表明，0.10～017 g/mL的大蒜素抑菌效果較好且對植物生長影響較小，代森錳鋅0.1～0.7 g/L抑菌效果較好且對植物的根和芽生長有明顯的促進作用[11]。趙青華等用6種不同的抑菌劑對魔芋進行開放組培，試驗發現抑菌劑對愈傷組織的分化影響較大，容易引起愈傷組織褐變，濃度越低影響越小，且分化的試管苗長勢也比傳統組織培養試管苗弱[6]。王丹等首次運用食品添加劑山梨酸鉀作為開放組培的抑菌劑，發現0.02 g/L的山梨酸鉀能有效抑制紅豆杉開放組培中培養基的污染[10]。

目前利用次氯酸鈉、山梨酸鉀、代森錳鋅、大蒜素等作為開放式組織培養的抑菌劑均獲得了組培苗（表2）。

表2 植物開放式組織培養中抑菌劑的應用情況

試驗材料 抑菌劑種類 抑菌劑濃度 外植體生長狀況

香蕉繼代叢生芽 次氯酸鈉 0.01%

荸薺莖芽 次氯酸鈉 1.0%

魔芋 H198 400倍液 比傳統試管苗弱

梅花莖段 特制消毒液 0.7%

紅豆杉三年生葉片 山梨酸鉀 0.02 g/L 污染率較高，存活率低

馬鈴薯試管苗 YI-1 62.5 g/mL 苗粗壯、葉片多、顏色綠、擴展

葡萄莖段 特制消毒液 0.2% 苗生長健壯，分化率較高

白菜種子 大蒜素 0.10～0.17 g/mL 種子萌發率80%以上，芽的生長與對照組無顯著性差異

白菜種子 代森錳鋅 0.1～0.7 g/L 種子萌發率88%以上，芽的生長與對照組無顯著性差異

2 培養容器

傳統的植物組織培養所用容器為錐形瓶，以塑料膜封口或用棉球塞封口，且容器要求能耐高溫高壓。而開放式組織培養采用培養基中添加抑菌劑代替高溫高壓滅菌，所以容器的選擇范圍大。為了降低成本，簡化程序，報道的試驗所用培養容器均為一次性塑料杯，以保鮮膜封口。但趙青華等在對魔芋進行開放式組織培養時進行了不同培養容器的對比試驗，結果表明，一次性塑料杯由于質量過輕，操作起來不方便，且長期使用成本高，傳統的培養容器如錐形培養瓶和方形培養盒雖然一次性投入高，但能反復使用，且外植體生長良好，是開放式組織培養的最佳選擇[6]。

3 無機碳和有機物質

蔗糖是外植體生長發育的碳源和能量來源，沒有能量和碳源任何細胞都不能生長，植物不能進行正常的細胞分裂與組織分化。當生長素水平恒定時，2%蔗糖有利于分化出木質部，4%蔗糖則有利于分化出韌皮部，3%的蔗糖則可以分化出二者，所以3%是植物組織培養常用的蔗糖濃度。植物組織培養中蔗糖是碳源和能量的供給物，同時也是微生物孳生的主要原因。為了降低污染率，研究者們采用降低蔗糖濃度、無糖培養等方式進行。有關蔗糖濃度與開放式組織培養中污染率之間的關系少有報道。吳桂容等在荸薺的開放式組織培養中發現，蔗糖濃度為2%時污染率最低而誘導率高，雖然隨著蔗糖濃度的提高，誘導率升高，但污染率也隨之升高[7]。在磨芋的開放式組織培養中，趙青華等通過4個蔗糖濃度對比試驗，結果表明，3%的蔗糖濃度有利于魔芋的誘導培養[6]。

無糖培養是采用人工環境控制手段，用CO2代替蔗糖作為碳源，提供植株生長適宜的光、溫、水、氣、營養等條件，促進植株的光合作用，從而促進植物的生長發育。張偉在紅掌的快繁中發現，如果不具備上述的無糖培養條件，僅在培養基中不添加蔗糖，雖然接種后由于無糖作為污染源，污染率大大降低，但外植體不會發生愈傷組織，增殖率很低，增殖系數只有1.81，且生長緩慢;而繼代培養的植株由于有了完整的莖、葉，具備一定的自養能力，不加蔗糖也能存活但植株基本無變化[15]。

有機成分在生物生長發育過程中參與了生物體的新陳代謝，是所有生物體不可缺少的重要營養物質。曹善東等對影響草莓組織培養繁殖系數的有機物因素進行了對比試驗，結果表明，甘氨酸是影響草莓繁殖系數的主要有機物因子，且濃度以2.0 mg/L為最適宜[16]。張清霞等將B5-10培養基中的有機物加倍，發現有機物加倍對某些大白菜品種花藥培養的出胚率無影響，而對一些難誘導出胚的品種則有促進作用;添加絲氨酸使花藥培養的出胚率降低，而添加0.4 g/L谷酰胺對一些品種的胚誘導效果好[17]。有機物質與污染率有一定的關系，荸薺的開放式組織培養中，去掉培養基中的有機成分能有效降低污染率，尤其是去掉甘氨酸后，污染率最低[7]。

4 培養方式

培養方式對開放式組織培養的影響鮮見報道。吳桂容等在荸薺的開放式組織培養中進行了培養方式對其污染率和誘導率的影響試驗，結果表明，培養室內污染率最低，玻璃溫室和塑料溫室的污染率都較高[7]。固體培養與液體培養對開放式組織培養的影響還未見報道，僅王趙玉等在B5的固體培養基和液體培養基中加入了不同的抑菌劑對白菜種子進行開放式組培[11]，但未進行固體與液體培養基對開放式組培的影響的對比。張慎等認為循環流動的液體培養基不易受微生物的侵蝕，比固體培養基更適合于植物開放式組織培養[1]。

5 接種條件

傳統組織培養中，接種用的工具如鑷子、刀片等均采用高溫高壓滅菌或乙醇燈灼燒滅菌或專用接種滅菌器滅菌。而開放式組織培養中，省掉了高溫高壓滅菌這一過程，崔剛等將接種工具用75%乙醇擦洗后放在抑菌劑中浸泡1 h，接種過程中鑷子和刀片一直浸泡在抑菌劑中，這樣可有效防止接種工具引起的污染[2]。趙青華等通過試驗表明在魔芋的開放式組織培養中，培養瓶不需要進行特殊的殺菌處理，接種盤、鑷子和刀片用抑菌劑浸泡處理即可達到滅菌效果[6]。

6 發展前景

植物開放式組織培養技術對環境無嚴格的無菌要求，操作程序簡化，成本降低，是未來植物組織培養發展的主要方向。既能抑菌又不影響外植體生長的抑菌劑是植物開放式組織培養技術的核心，故尋找有效的抑菌劑是研究者們工作的重點?？股乜咕Ч^好，但有一定的抗菌譜且對外植體生長有一定的影響?；瘜W農藥及家用消毒劑的加入對外植體的生長發育有一定的影響。利用生物提取物制成的中藥混合物作為抑菌劑一直是研究者們比較認同的有效抑菌劑，但是中藥的選擇及提取過程比較繁瑣。一些具有抗菌作用的蛋白質如乳鐵蛋白和溶菌酶等，對外植體無任何副作用且不誘導微生物的抗性，可能是將來開放組培中抑菌劑的主要成分。

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