桑樹白藜蘆醇合酶基因全長克隆及序列分析

夏海武+曹慧+王效忠

摘要：根據已知的其他物種白藜蘆醇合酶cDNA保守序列設計引物，用RT-PCR技術從桑葚中擴增獲得白藜蘆醇合酶基因部分cDNA序列，再用RACE技術獲得其兩端序列，并拼接得到完整的1 442 bp白藜蘆醇合酶基因。經序列分析發現，桑樹白藜蘆醇合酶基因開放閱讀框長1 170 bp，編碼389個氨基酸，氨基酸序列含有芪合酶家族特征信號區GVLFGFGPGLT和活性中心序列GCFAGGTVLR;該基因與花生芪合酶基因的核苷酸序列同源性高達82.82%，氨基酸序列的同源性高達87.15%。

關鍵詞：桑樹;白藜蘆醇合酶基因;RT-PCR;RACE技術;序列分析

中圖分類號： Q943.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0017-04

收稿日期：2014-07-09

基金項目：山東省自然科學基金（編號：ZR2010CL022）;山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室（濰坊學院）開放課題（編號：2012SWKF02）。

作者簡介：夏海武（1958—），男，山東濰坊人，博士，教授，從事植物生物技術研究。E-mail：xiahaiwu206@163.com。

桑葚為?？坡淙~喬木桑樹（Morus alba Linn.）的果實，聚花果，每年4—6月份成熟，不同生長環境、不同品種的果實之間存在差異。中國地大物博，桑葚資源豐富，全國各省份均有桑樹的分布[1-2]。桑葚含有豐富的營養物質，具有食用及中藥材之用，早在2 000多年前，它就成為皇帝的御用藥品之一。1993年，國家衛生部把桑葚列為“既是食品又是藥品”的農產品之一[3]?，F已證明桑葚具有6種防病保健功能，包括防癌抗誘變、增強免疫力、保腎護肝、駐顏抗衰老、促進造血細胞生長、降低血糖血脂等[4]，這些保健功能主要依賴于桑葚中含有的一種叫白黎蘆醇的芪類物質，它具有抗氧化及消除自由基功效，有防癌、抗炎、預防心血管疾病、抗衰老等功能[5-6]。白藜蘆醇和其他芪類化合物均屬于次生代謝物，其生物合成途徑是苯丙氨酸-丙二酸，在白藜蘆醇合成全過程中，白藜蘆醇合酶（RS）是代謝途徑中最后一個起作用的關鍵酶[7]，也是合成途徑中唯一必需的合成酶，它催化1分子4-香豆酰輔酶A和3分子丙二酰輔酶A反應合成白藜蘆醇[8]。白藜蘆醇合成的底物在植物體內廣泛存在，白藜蘆醇的合成及含量控制主要依賴于白藜蘆醇合酶基因的表達狀況[9]，但大多數植物不含白藜蘆醇合酶或含量很低。目前，雖然發現含有白藜蘆醇的植物已有70多種，但要從天然植物中提取到高豐度的白藜蘆醇比較困難，并且提取成本較高。利用基因工程技術使更多的植物產生白藜蘆醇或提高植物體內白藜蘆醇的含量，滿足人們醫療保健需求具有重要的現實意義。 目前，已從松樹、花生、葡萄、爬山虎、大黃等植物中分離到白藜蘆醇合酶基因，但還沒有從桑葚中克隆白藜蘆醇合酶基因全長序列的報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 桑樹接近成熟的果實，采自山東省濰坊市農業科學院。采后洗凈，每2 g為1份，裝于5 mL離心管中，液氮速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.1.2 試劑盒、酶和試劑 DNA片段快速純化/回收試劑盒，購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司;cDNA第一鏈合成試劑盒，購于Fermenta公司;RACE試劑盒，ClonTech公司產品;pMD 18-T Vector Kit、Marker （DL2000）、T4-DNA連接酶、5.0 U/μL Taq DNA polymerase，購于TaKaRa生物工程 （大連）有限公司;其他試劑，分析純，均為國產或進口。

1.1.3 試驗用具與耗材的預處理 用于RNA提取的研缽、藥匙、鑷子、50 mL離心管、試劑瓶等器具，用0.1% 焦炭酸二乙酯處理過夜;無RNA酶的專用槍頭、PCR管、1.5 mL離心管等耗材，經1.1 MPa、121 ℃高壓滅菌30 min或在干燥箱中60 ℃烘干，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑葚總RNA的提取與檢測

1.2.1.1 桑葚總RNA的提取 迅速從-80 ℃冰箱中取出桑葚2 g，置于用液氮預冷的研缽中，加入PVPP 0.2 g，研磨成細粉末，在研磨時不斷加入液氮以不讓組織解凍;在50 mL離心管中，加入經65 ℃預熱的CTAB提取緩沖液20 mL和β-巰基乙醇400 μL，倒入研磨好的桑葚細粉末，充分振搖混勻，65 ℃水浴30 min;取出，冷卻至室溫，加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比49 ∶ 1），混勻，于4 ℃、20 000 g離心20 min;將上層水相移至另1支離心管中，加入1/4體積10 mol/L氯化鋰，混勻，4 ℃冰箱沉淀過夜;4 ℃、20 000 g離心20 min，棄上清，用2 mol/L氯化鋰洗滌沉淀1次，4 ℃、20 000 g離心 10 min，取沉淀;用2 mL無RNase的ddH2O溶解沉淀，轉入4個1.5 mL離心管中，加等體積的氯仿-異戊醇（體積比49 ∶ 1）顛倒混勻，于4 ℃、20 000 g 離心20 min;將上層水相移至新的離心管中，加入1/10體積3 mol/L、pH值為5.2的乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，置于-20 ℃冰箱1 h以沉淀RNA;4 ℃、20 000 g離心 15 min，棄上清，沉淀用75%乙醇漂洗2次，真空抽干5 min;加入100 μL無RNase的ddH2O充分溶解，放-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 電泳檢測 將電泳槽、制膠板、梳子等用DNA-RNA Away處理，晾干，用1×TAE電泳緩沖液配制1.0%瓊脂糖凝膠;待凝固，點入3 μL提取的RNA樣品，在預冷的1×TAE電泳緩沖液中，100 V電壓條件下電泳20 min左右;觀察凝膠成像儀上RNA條帶的清晰度和完整性，拍照。

1.2.2 桑葚芪合酶保守區cDNA的克隆

1.2.2.1 引物設計 根據GenBank中葡萄和花生白藜蘆醇合酶基因的核苷酸序列，分別設計桑葚白藜蘆醇合酶基因保守區的上、下游引物。上游引物（BP1）為：5′-GGCCAGCCAATGTCTAAGATCAC-3′，下游引物（BP2）為：5′-CTGCGGAGGACAACAGTTTCAAC-3′，由上海生工生物技術有限服務公司合成。

1.2.2.2 桑葚白藜蘆醇合酶保守區cDNA的RT-PCR擴增 按照試劑盒說明書進行，50 μL反應體系為：10×PCR buffer （Mg2+Plus） 5.0 μL，cDNA 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。取10 μL產物在1.0%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液、90 V電壓條件下電泳30 min，其余產物用于回收。

1.2.2.3 目的片段的回收 從瓊脂糖凝膠上切下目的片段條帶稱重，裝入1.5 mL離心管中，按照北京鼎國昌盛生物技術有限公司的DNA片段快速純化/回收試劑盒說明書進行操作，得到純化的PCR產物。

1.2.2.4 目的片段與載體的連接與轉化 按TaKaRa公司的pMD 18-T Vector Kit說明書，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α。大腸桿菌感受態細胞的制備及其轉化采用CaCl2法。

1.2.2.5 重組質粒的PCR檢測與測序 挑取白色菌斑置于加抗生素的LB培養基中，對菌液進行PCR檢測，20 μL反應體系為：10×PCR buffer （Mg2+Plus） 2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，菌液2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.3 μL，加無菌ddH2O 至20 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 15 min，30個循環;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。取10 μL產物在1.0%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液、90 V電壓條件下電泳30 min，在凝膠成像儀上觀察并拍照，并將擴增出目的條帶的樣品菌液送上海生工生物工程技術有限服務公司進行測序。

1.2.3 桑葚芪合酶cDNA全長的克隆

1.2.3.1 引物設計及合成 根據保守區cDNA的測序結果和ClonTech公司BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit說明書要求，設計3′RACE上游引物（SP2）為：5′-CTATCTTAACAAGAGTGTTCCCG-3′和5′RACE下游引物（SP1）為：5′-GCGGTATTCTCAGAGCAAACAATGAG-3′，引物序列委托上海生工生物工程技術有限服務公司合成。

1.2.3.2 第一鏈cDNA的合成 按照試劑盒操作說明書進行，5′RACE CDS 引物序列為：5′-（T）25VN-3′，（N=A、C、G或T;V=A、G或C）;3′RACE CDS 引物序列為：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC（T）30VN-3′;BD SmartⅡ A oligo序列：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′。

1.2.3.3 cDNA末端的快速擴增 3′RACE PCR擴增體系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×BD Advantage 2 PCR buffer 5.0 μL，3′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL，UPM（10×） 5.0 μL ，10 μmol/L SP2 1.0 μL，10 μmol/L dNTP Mix 1.0 μL，50×BD Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL。5′RACE PCR擴增體系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×BD Advantage 2 PCR buffer 5.0 μL，5′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL，UPM（10×） 5.0 μL，10 μmol/L SP1 1.0 μL，10 μmol/L dNTP Mix 1.0 μL，50×BD Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL。其中，UPM是通用引物混合物，其長序列為：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，短序列為：5′-CTAATACGACTCACTATAGGG C-3′。PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。取10 μL產物在1.0%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液、90 V電壓條件下電泳30 min，其余產物用于回收?；厥盏腜CR產物，進行電泳、回收、連接、轉化和藍白斑篩選。

1.2.3.4 重組質粒的PCR檢測 將白斑挑起，液體培養過夜，進行菌液PCR檢測。20 μL反應體系為：10×PCR buffer （Mg2+Plus） 2.0 μL，菌液2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，UPM（10×） 5.0 μL，10 μmol/L SP（5′ RACE加SP1，3′RACE加SP2） 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.5 μL，加無菌ddH2O 至20 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性2 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環;72 ℃延伸 10 min;4 ℃保存。取10 μL產物在1.0%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液、90 V電壓條件下電泳30 min，將含重組質粒的陽性菌液送上海生工生物工程技術有限服務公司測序。

2 結果與分析

2.1 桑葚總RNA的提取結果

由圖1可見，提取的桑葚總RNA樣品可以看到3條帶，分別為28S、18S和5S，其中28S、18S條帶整齊清楚，且28S條帶比18S條帶更亮，5S條帶非常暗淡，這說明桑葚的總RNA完整性較好，沒有出現降解。RT-PCR擴增和RACE試驗結果進一步證實，提取的桑葚總RNA質量較高、完整性好，能滿足多數分子生物學試驗要求。

2.2 桑葚白藜蘆醇合酶保守區cDNA的PCR擴增與序列分析

將桑葚總RNA進行逆轉錄合成cDNA第一鏈，再以cDNA第一鏈為模板，以BP1和BP2為上、下游引物進行PCR擴增，得到1條800 bp左右的特異條帶（圖2）。

將該產物進行克隆、菌液PCR檢測，將檢測結果陽性的相應菌液送樣測序，結果表明，該PCR產物的大小為806 bp。由此推導出的氨基酸序列編碼268個氨基酸，其中包含植物芪合酶的活性中心和家族特征信號區，該PCR產物是桑葚白藜蘆醇合酶保守區cDNA片段。

2.3 桑葚白藜蘆醇合酶cDNA的RACE與序列分析

在桑葚白藜蘆醇合酶保守區cDNA內，各設計1條正向引物SP2和反向引物SP1，采用BD SMARTTM RACE 技術，分別進行3′端和5′端的PCR擴增，電泳檢測結果表明，3′RACE和5′RACE特異條帶的大小均在500～750 bp之間（圖3、圖4）。將這2個特異片段進行克隆、菌液PCR檢測，結果表明，3′RACE和5′RACE樣品電泳都有預計大小的特異條帶。測序結果表明，3′RACE產物的大小為635 bp，該序列與保守區有361 bp的重疊區，在第481～485 bp處存在加尾信號序列AATAA，在序列的末端含有19個A的poly（A）尾巴;5′RACE產物的大小為585 bp，該序列與保守區有232 bp的重疊區。由此推斷，這2個片段分別是桑葚白藜蘆醇合酶cDNA的3′端和5′端。

2.4 桑葚白藜蘆醇合酶cDNA全長的獲得與序列分析

由圖5可見，桑葚白藜蘆醇合酶cDNA編碼區長度為 1 170 bp，編碼389個氨基酸，該氨基酸序列含有芪合酶的活性中心序列GCFAGGTVLR和家族特征信號區GVLFGFGPGLT;在起始密碼子ATG上游有11 bp的5′端非編碼區，在終止密碼子TAA下游有259 bp的3′端非編碼區序列，其中，在第1286～1290 bp為加尾信號AATAA。

將桑葚與其他植物白藜蘆醇合酶基因編碼區核苷酸序列與氨基酸序列進行比較，結果（表1）表明，桑葚白藜蘆醇合酶與花生的同源性較高，核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高分別達到82.82%和87.15%，與葡萄的同源性在60%左右。這說明桑葚白藜蘆醇合酶基因與以往克隆的白藜蘆醇合酶基因有一定的進化距離。

3 結論

近年來，人們發現至少21科31屬72種植物中存在白藜蘆醇，日常生活中人們喜聞樂見的食物如葡萄、桑葚、花生、鳳梨等含有白藜蘆醇，許多常見的藥用植物中也含有白藜蘆醇，如決明、藜蘆、何首烏、虎杖等。已有資料表明，不同類群植物中白藜蘆醇的含量差異很大，且多數植物中白藜蘆醇含量都很低。筆者用高效液相色譜法測得桑葚中白藜蘆醇的鮮質量

含量為26.88 μg/g[10]，這說明桑葚中具有較高活性的白藜蘆醇合酶基因。本試驗采用RACE方法成功克隆出桑葚的白藜蘆醇合酶基因全長，為白藜蘆醇合酶的基因工程奠定了良好的基礎。

表1 桑葚與花生、葡萄白藜蘆醇合酶基因編碼區核苷酸

和氨基酸序列同源性比較

植物名稱 基因登錄號 核苷酸序列

同源性（%） 氨基酸序列

同源性（%）

桑葚 100 100

花生 AB027606 80.68 85.60

花生 AF227963 81.37 85.09

花生 AY170347 81.20 84.83

花生 AY826726 80.94 86.38

花生 DQ124938 80.85 85.60

花生 L00952 82.82 87.15

葡萄 AB046373 60.77 66.07

葡萄 AB046374 60.69 66.33

葡萄 AB046375 60.45 65.82

葡萄 AF128861 60.22 66.84

葡萄 AF274281 64.55 65.05

葡萄 DQ366301 63.16 66.58

葡萄 DQ366302 64.29 65.56

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