巴西橡膠樹棒孢霉落葉病病菌蛋白激酶基因突變體⊿CCK1的互補載體構建及轉化

曹申文+蒲金基+張欣+漆艷香+韋運謝+劉曉妹

摘要：為了明確蛋白激酶CCK1在巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌中的致病相關功能，在前期研究基礎上通過PCR擴增，獲得了該基因1 604 bp的5′端片段（L-C5）和131 bp的3′端片段（L-C3），同時以pCAMBIA3300質粒為模板擴增獲得了552 bp抗性標記基因（L-Bar），并用In-Fusion HD Cloning Kit將L-Bar基因反向插入了L-C5和L-C3序列之間，克隆至pUC19載體上，成功構建了⊿CCK1突變體的互補載體p⊿CCK1-C。再從該載體上擴增互補片段，借助PEG介導法轉化⊿CCK1突變體的原生質體，經Basta平板篩選、PCR檢測和測序鑒定表明，獲得了⊿CCK1突變體的互補轉化子。為進一步明確CCK1基因在巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌中的致病相關功能打下了材料基礎。

關鍵詞：多主棒孢菌;蛋白激酶基因CCK1;⊿CCK1突變體;互補載體;互補轉化子

中圖分類號： S435 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0027-03

收稿日期：2014-10-15

基金項目：中西部高校項目（編號：ZXBJH-XK005）;海南大學青年基金（編號：qnjj1212）;海南大學科研啟動基金（編號：kyqd1427）。

作者簡介：曹申文（1990—），女，碩士研究生，主要從事植物病原真菌分子生物學研究。E-mail：hongshangcsw@qq.com。

通信作者：劉曉妹，博士，副教授，主要從事熱帶作物病害病原菌致病基因研究。E-mail：lxmpll@126.com。

由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola （Bert.&Curt.）Wei]引起的巴西橡膠樹棒孢霉落葉病是巴西橡膠樹的重要病害之一，現已在世界天然橡膠生產國普遍分布，該病害常造成橡膠樹周年反復落葉，植株生長遲緩，枝條回枯或整株死亡，一般膠乳減產20%～45%[1-2]。目前，國內外對該病害的研究在病害診斷、病原菌生物學、病害流行學和防治技術等方面取得了較大進展[3-7]，但在分子生物學研究方面僅報道了4個致病相關基因CCK1[8]、CMP1[9]、CCHog1[10]、cas[11]，且大多處于序列特征分析階段。其中，CCK1是本實驗室從巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌中克隆獲得的一個PMK1類促分裂原活化蛋白激酶基因[12]，經前期鑒定，初步確定CCK1基因可能在多主棒孢菌的菌落和菌絲形態、產孢、對環境的識別、毒素的產生以及致病性等方面起重要作用，并參與調控高滲脅迫反應[8]。但這些功能仍需通過互補突變體試驗來進一步明確，而通過構建其互補載體和轉化突變菌株獲得互補菌株是關鍵步驟。本研究以Bar基因為抗性選擇標記，用In-Fusion HD Cloning Kit成功構建了⊿CCK1突變體的互補載體p⊿CCKB，并轉化了⊿CCK1突變株的原生質體，獲得 ⊿CCK1 互補菌株，為明確CCK1基因的功能、揭示巴西橡膠樹棒孢霉病菌致病機制打下了材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株和質粒：巴西橡膠樹棒孢霉落葉病病菌CC004菌株和含Bar基因的質粒pCAMBIA3300，均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所提供。CCK1基因突變體 ⊿CCK1 由筆者所在課題組提供。

供試試劑：Fungal gDNA Kit 和Mini Plasmid Kit 為BioMiga 公司產品;In-Fusion HD Cloning Kit為Clontech 公司產品;Peasy-T1和大腸感受態大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α為TransGen Biotech公司產品;2×（HS）Taq-Mixture Kit 和TIANgel Midi Purification Kit為TIANGEN公司產品;核酸分子質量標準購自廣東省廣州東盛生物科技有限公司;GoldView DNA染料購自北京賽百盛基因技術有限公司;溶壁酶購自廣東省微生物研究所;Ampicillin和Basta為Amresco進口分裝;其他試劑為國產分析純;引物合成和測序均由華大基因生物科技有限公司（深圳）完成。 供試引物見表1。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 接種巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌CC004菌餅于PD培養液中，28 ℃、150 r/min、黑暗搖床培養4～5 d，收集菌絲，用Fungal gDNA Kit提取基因組DNA。 1.2.2 ⊿CCK1突變體的互補載體構建 先以野生菌株CC004的gDNA和質粒pCAMBIA3300為模板，分別擴增CCK1基因5′端片段C5（包含CCK1基因編碼區上游序列和CCK1基因編碼區全長序列）、3′端片段C3（CCK1基因終止密碼子后的一段序列）及完整的Bar基因，分別克隆于Peasy-T1載體上，選擇陽性克隆測序，再以序列完全正確的陽性克隆為模板，分別擴增含同源重組序列的CCK1基因5′端、3′端和Bar片段L-C5、L-C3、L-Bar。純化擴增產物，再用In-Fusion HD Cloning Kit 將L-Bar基因反向連接于 L-C5 和L-C3之間，連接至pUC19載體上，轉化大腸桿菌 DH5α，用pUC19載體通用引物檢測克隆，挑陽性克隆測序，篩選插入片段序列沒有堿基錯配的克隆提取質粒，即完成CCK1基

表1 所用引物信息

序號 擴增片段 引物序列

1 C5：CCK1基因上游 F：5′-CCCGTTCATTGTCCCA-3′;R：5′-GAGTCATACAGCCGAGCC-3′

2 C3：CCK1基因下游 F：5′-GGTGCCATGTCTGAGCA-3′;R：5′-CGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′

3 Bar：除草劑Bar基因 F：5′-ATGAGCCCAGAACGACGC-3′;R：5′-TCTCAAATCTCGGTGACG-3′

4 L-C5：CCK1基因上游重疊片段 F：5′-CGGTACCCGGGGATCCCCGTTCATTGTCCCA-3′;R：5′-GAGTCATACAGCCGAGCC-3′

5 L-C3：CCK1基因下游重疊片段 F：5′-GGTGCCATGTCTGAGCA-3′;R：5′-CGACTCTAGAGGATCCGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′

6

L-Bar：除草劑Bar基因重疊片段

F：5′-TCGGCTGTATGACTCTCAAATCTCGGTGACG-3′;R：5′-CTCAGACATGGCACCATGAGCCCAGAACGACGC-3′

7 pUC19載體通用引物 F：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′;R：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′

8 ⊿CCK1突變體互補片段 F：5′-CCCGTTCATTGTCCCA-3′;R：5′-GGTAACAGGCAGGATTAGAT-3′

9 FBB：檢測轉化子特異性引物 F：5′-TGGTGGAACAATGGCTAATGG-3′;R：5′-GCCGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′

注：邊框部分序列為L-C5或L-C3與pUC19載體重疊序列;劃單線部分序列為L-Bar與片段L-C5或L-C3重疊序列。

因互補載體的構建（圖1）。

（1）目的片段擴增。構建CCK1基因互補載體所需引物見表1。擴增體系（50 μL）：gDNA或質粒pCAMBIA3300 2 μL、dNTPs（各2.5 mmol/L） 5 μL、上或下游引物 （10 μmol/L）各2 μL、5×TransStart FastPfu buffer 10 μL、TransStart FastPfu DNA Polymerase （2.5 U/μL） 1 μL、ddH2O 28 μL。C5/L-C5擴增程序：95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，循環35周;72 ℃ 10 min，預期大小約為 1 600 bp。C3/L-C3擴增程序：95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循環35周;72 ℃ 5 min，預期大小約 100 bp。Bar/L-Bar擴增程序：95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環35周;72 ℃ 5 min，預期大小約550 bp。

（2）互補載體p⊿CCK1-C的生成。連接體系20 μL：pUC19 Control Vector Linearized （50 ng/μL） 2.0 μL、Purified products（100～200 ng/μL）2.0 μL、5×In-Fusion HD Enzyme Premix（5 U/μL）6.0 μL、ddH2O 6.0 μL。上述混合液50 ℃ 孵育15 min后，進行克隆轉化大腸桿菌DH5α。并用pUC19載體通用引物檢測克隆，預期片段大小約為2 400 bp。送陽性克隆測序，將序列完全正確重組質粒命名為p⊿CCK1-C，即獲得了⊿CCK1突變體互補載體。

1.2.3 ⊿CCK1突變體互補轉化子的獲得和PCR驗證

1.2.3.1 ⊿CCK1突變體互補片段的擴增 以L-C5：：Bar：：L-C3基因序列設計引物CCKB-F/R，以p⊿CCK1-C為模板，擴增一段含完整CCK1基因、Bar基因和CCK1基因終止密碼子后一段序列的片段。擴增體系同上。擴增條件：95 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min 30 s，循環35周;72 ℃ 10 min。該片段預期大小2 196 bp。用TIANgel Midi Purification Kit回收該片段?？寺y序正確后，再純化用作互補片段。

1.2.3.2 互補片段的轉化 參照劉曉妹的方法[1]，將回收的片段在PEG介導作用下轉化⊿CCK1突變體原生質體，用含 4 mg/mL Basta（對CC004和⊿CCK1菌株的最低抑菌濃度）的PDS培養基進行篩選培養，培養條件為28 ℃黑暗。待有菌落長出后，用無菌牙簽蘸取邊緣菌絲，接于含4 mg/mL Basta的PDA平板上進行連續5次純化。

1.2.3.3 互補轉化子的PCR驗證 用Fungal gDNA Kit提取野生型菌株CC004、⊿CCK1突變體和純化后的互補轉化子基因組DNA。用特異性引物FBB-F/R進行PCR鑒定，預期在野生型菌株CC004中擴增到的條帶大小約1 100 bp，在⊿CCK1突變體中擴增不到條帶，在互補轉化子中能擴增到約 1 600 bp 條帶的即為⊿CCK1突變體的互補轉化子。將符合預期的互補轉化子條帶回收并克隆到Peasy-T1上并測序，進一步驗證序列的正確性。

2 結果與分析

2.1 巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌CC004基因組DNA的提取

從圖2可以看出，在15 000 bp以上位置有清晰條帶?？梢娝崛〉腃C004菌株的DNA比較完整，適合進行下一步試驗。

2.2 ⊿CCK1突變體的互補載體構建

2.2.1 目的片段擴增 C5、C3、Bar擴增條帶分別在約 1 600、550、100 bp處，符合預期大?。▓D3）。擴增產物經過克隆測序后，選擇序列完全正確的陽性克隆進行下一步試驗。

2.2.2 ⊿CCK1突變體互補載體p⊿CCK1-C的生成 以獲得序列正確的陽性克隆為模板，用高保真酶擴增回收L-C5、L-C3、L-Bar片段，用In-Fusion HD Cloning Kit 將其連接至pUC19載體上，轉化大腸桿菌DH5α，挑選了12個克隆，用載體通用引物M13-F/R檢測，結果表明，在12個克隆中均擴增到了約2 400 bp的片段（圖4），符合預期大小。測序結果表明，有3個陽性克隆的序列完全正確，說明 ⊿CCK1 突變體的互補載體p⊿CCK1-C構建成功。

2.3 ⊿CCK1突變體互補轉化子的獲得和PCR驗證

以互補載體質粒p⊿CCK-C為模板，用引物組合CCKB-F/R擴增獲得了一段大小約2 200 bp的互補片段（圖5）。用該片段轉化⊿CCK1突變體原生質體，經過含Basta的平板篩選和純化后，提取基因組，用特異性引物FBB-F/R擴增驗證。結果表明，在野生型CC004基因組中擴增到大小為

1 100 bp的條帶，在⊿CCK1突變體中未擴增到條帶，在9個互補轉化子中擴增到大小約為1 600 bp的條帶，送樣測序，其中3號樣與預期完全相符（圖6）。說明⊿CCK1突變體的互補轉化子獲得成功。

3 結論與討論

基因敲入是通過同源重組的方法，將基因編碼序列用另一基因編碼序列進行替換的技術。通過基因敲入，可以讓基因在體內表達、研究其功能;也可以將正?；蛞牖蚪M中置換突變基因以達到驗證其基因功能的目的[13]。本研究構建的p⊿CCK1-C基因互補載體屬于置換型載體。已有文獻報道，在構建基因敲除置換型載體時，目的基因兩端的同源序列越大，發生同源重組的概率越高。對于絲狀真菌而言，同源序列最好在500 bp以上[14]。且由于線性化質粒相對于環形質粒而言有可能更有利于提高轉化率，本試驗以互補載體p⊿CCK1-C為模板擴增長片段序列進行原生質體轉化。本試驗構建的p⊿CCK1-C載體，同源片段為887 bp，置換片段與⊿CCK1突變體也仍有814 bp同源序列，符合置換載體的構建要求。將置換片段PEG介導轉化⊿CCK1突變體，成功獲得⊿CCK1突變體的互補轉化子。

傳統的載體構建方法需要載體外對DNA 片段進行繁瑣的酶切、連接、亞克隆和鑒定等步驟，費力費時[15]。本試驗采用了Clontech公司的In-fusion克隆技術。該技術通過相連片段附加15 bp同源堿基令不同片段進行平末端連接，不附加多余序列，也不受限制性酶切位點的限制，簡便、高效。

前期筆者所在課題組已成功獲得CCK1基因敲除突變體⊿CCK1，表型測定表明，⊿CCK1完全失去產孢能力菌餅接種時，⊿CCK1突變體致病力喪失，且在菌落和菌絲形態、對環境的識別、毒素的產生等方面也與野生型存在明顯的差異[8]。本研究將在后續試驗中通過測定互補轉化子表型，為進一步明確CCK1在巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌中的致病相關功能打下了良好的材料基礎。

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