胃癌伴神經內分泌分化HER-2基因擴增和蛋白表達及預后分析

宋魏，于慶凱△，張晶晶，張建波，孫淼淼

胃癌伴神經內分泌分化HER-2基因擴增和蛋白表達及預后分析

宋魏1，于慶凱1△，張晶晶2，張建波1，孫淼淼1

目的 觀察胃癌伴神經內分泌分化（NED）和胃癌中HER-2基因擴增及蛋白表達情況。方法 回顧性分析胃癌伴神經內分泌分化患者70例和具有相同分期的胃癌患者150例，采用免疫組化法（IHC）聯合雙色銀染色素原位雜交（DISH）檢測胃癌伴NED和胃癌中HER-2基因擴增和蛋白表達情況，并對胃癌伴NED進行預后分析。結果 胃癌伴NED和胃癌中HER-2蛋白過表達率分別為20.00%和21.33%，HER-2基因擴增率分別為8.57%和14.67%。HER-2蛋白表達、HER-2基因擴增及基因擴增類型2組間差異均無統計學意義；胃癌伴NED17號染色體多體與HER-2基因擴增呈正相關。胃癌伴NED患者中HER-2基因擴增者術后生存期短于HER基因不擴增者。多因素分析顯示胃癌伴或不伴NED、HER-2基因是否擴增、淋巴結轉移和手術方式是預后的獨立影響因素。結論 胃癌伴NED屬于胃癌特殊類型，其HER-2基因擴增、蛋白表達情況和胃癌相同，HER-2基因擴增的胃癌伴NED患者預后差。

癌，神經內分泌；胃腫瘤；原癌基因蛋白質類；原位雜交；基因擴增；HER-2；蛋白表達

人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）是一種跨膜酪氨酸蛋白激酶受體，其基因擴增及其蛋白過表達是乳腺癌預后的判斷因子之一，與預后不良及存活期較短相關。越來越多的證據表明，HER-2是重要的生物學標志物，在胃癌發生中起關鍵作用，其擴增率或過表達率為7%～34%，HER-2陽性的胃癌可能預示腫瘤惡性程度高和預后不良［1］。胃癌伴神經內分泌分化（neuro?endocrine cell differentiation，NED）是胃癌的一種特殊類型，指分化的神經內分泌細胞以單個或者細胞巢的形式散在分布于胃癌細胞之間，其神經內分泌細胞占腫瘤成分≤30%。本研究回顧性分析70例胃癌伴NED和150例具有相同分期的胃癌患者，比較兩者HER-2基因擴增和蛋白表達情況有無差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料 根據免疫組化（IHC）結果從2011年1月—2014年1月河南省腫瘤醫院治療的875例胃癌患者中篩選出70例胃癌伴NED蠟塊（胃癌NED組）和150例具有相同分期的不伴NED的胃腺癌蠟塊（胃癌組）。胃癌NED組中，男52例，女18例，年齡（56.49±8.92）歲；胃癌組中，男119例，女31例，年齡（57.96±7.31）歲，2組間性別（χ2=0.441）、年齡（t=1.293）比較差異無統計學意義。所有患者均進行胃癌手術治療，其中155例進行根治切除，65例姑息切除。2組患者隨訪時間12～36個月，截止日期為2013年12月，無失訪病例。

1.2 IHC 試劑購均自VENTANA公司，采用VENTANA全自動免疫組織化學儀（Bench Maker）進行免疫組織化學染色，TBS代替一抗作為陰性對照，HER-2蛋白表達（+++）的乳腺非特殊型浸潤性癌為陽性對照。在胃癌組織切片中標記嗜鉻素A（CgA）、突觸素（Syn）、神經細胞黏附分子（CD56），染色定位于胞漿。3個特異的神經內分泌標志物中有任何一個標志物表達即判定為神經內分泌標志物陽性。在光鏡下觀察神經內分泌細胞在胃癌組織中以單個細胞或細胞巢形式分散存在，≤30%診斷為胃癌伴NED。HER-2蛋白表達結果：0（在＜10%的腫瘤細胞中無反應或細胞膜染色），+（在≥10%的腫瘤細胞中有微弱或不完整細胞膜染色），++（在≥10%的腫瘤細胞中有弱-中度的完全、基底外側或側面細胞膜染色），+++（在≥10%的腫瘤細胞中有強烈的完全、基底外側或側面細胞膜染色）。0和+視為無或低表達，++和+++視為過表達。

1.3 雙色銀染色素原位雜交（DISH） HER/17號染色體DNA雙探針及試劑均購自VENTANA公司，采用VENTANA全自動免疫組織化學儀（Bench Maker XT）對胃癌伴NED和胃癌HER-2蛋白過表達（IHC染色HER-2++和+++）的組織進行染色。腫瘤組織中計數20個細胞核17號染色體（紅色）拷貝平均值和HER-2基因（黑色）拷貝平均值。17號染色體拷貝數可表現為單倍體（1個紅色信號）、整倍體（2個紅色信號）和多倍體（≥3個紅色信號）。HER-2基因拷貝平均值與17號染色體拷貝平均值的比值≥2.0且＜6.0為擴增，比值＜2.0為無擴增，比值≥6.0為簇擴。

1.4 統計學方法 數據處理應用SPSS 19.0軟件，2組間率的比較采用χ2檢驗，兩變量間的相關性應用χ2檢驗并計算列聯系數進行分析，生存時間為胃癌手術之日至最后1次隨訪或死亡時間，并對其進行Log-rank檢驗，作出Kaplan-Meier生存曲線。運用Cox比例風險模型評估伴或不伴NED及各種臨床病理因素對胃癌患者預后的影響。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HER-2的蛋白表達水平和HER-2基因擴增情況 HER-2蛋白陽性信號定位于細胞膜，胞質著色罕見。胃癌NED組中HER-2蛋白表達情況為：0～+56例，++12例，+++2例，過表達率為20.00% （14/70），胃癌組中HER-2蛋白表達情況為：0～+ 118例，++17例，+++15例，過表達率為21.33%（32/ 150）。2組表達情況差異無統計學意義（χ2=4.384，P＞0.05），見圖1。HER-2基因DISH染色信號定位于細胞核。胃癌NED組的基因擴增6例（8.57%），胃癌組的基因擴增22例（14.67%），差異無統計學意義（χ2=1.095，P＞0.05），見圖2。HER-2基因擴增情況：6例胃癌NED組中整倍體擴增1例，多倍體擴增3例，整倍體簇擴2例。22例胃癌組中整倍體擴增6例，多倍體擴增14例，整倍體簇擴2例，差異無統計學意義（χ2=2.296，P＞0.05）。

Fig.1 Positive HER-2 expression in gastric carcinoma with NED（SP，×400）圖1 胃癌NED組HER-2蛋白+++（SP，×400）

Fig.2 HER-2 amplification and Chromosome 17 euploid in gastric carcinoma with NED（DISH，×400）圖2 胃癌NED組HER-2基因擴增，17號染色體整倍體（DISH，×400）

2.2 胃癌NED組17號染色體多體與HER-2基因擴增的相關性 HER-2基因擴增的胃癌NED組中17號染色體整倍體3例，多倍體3例，HER-2基因不擴增的胃癌NED組中17號染色體整倍體60例，多倍體 4例，2組比較差異有統計學意義（χ2= 19.782），胃癌伴NED17號染色體多倍體與HER-2基因擴增存在關聯性（r=0.471，P＜0.05）。

2.3 生存分析

2.3.1 生存率分析結果 中位隨訪時間17個月（5～36個月），胃癌NED組HER-2基因擴增患者術后1年生存率為66.66%，3年生存率為0，中位生存期為13個月，胃癌NED組HER-2基因不擴增患者術后 1年生存率為 65.33%，3年生存率為26.56%，中位生存期為19個月，差異有統計學意義（χ2=5.116，P＜0.05），見圖3。

Fig.3 Kaplan-Meier survival curves of HER-2 gene amplification and HER-2 gene non-amplification in gastric cancer patients with NED圖3 胃癌伴NED患者HER-2基因擴增組與不擴增組Kapla-Meier生存曲線

Tab.1 Variable assignment of factors influencing prognosis of gastric cancer表1 胃癌預后影響因素變量賦值情況

2.3.2 多因素分析 以生存狀態為因變量（生存=0，死亡=1），以胃癌伴或不伴NED、HER-2基因是否擴增、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、性別、年齡、手術方式為自變量，將各因素納入COX風險比例模型，見表1、2。結果顯示胃癌伴或不伴NED、HER-2基因是否擴增、淋巴結轉移和手術方式是預后的獨立影響因素。

Tab.2 Assessment of independent factors influencing prognosis of gastric cancer patients in COX proportional hazard model表2 運用COX比例風險模型評估胃癌預后的影響因素

3 討論

2010 年第4版《世界衛生組織消化系統腫瘤》把通過IHC證實神經內分泌細胞在癌組織中≤30%診斷為胃癌伴NED，歸屬為腺癌范疇。把神經內分泌細胞達到30%定義為混合性腺神經內分泌癌［2］。胃腺癌伴NED現象在光鏡下難以判定，而超微結構觀察及免疫組織化學染色對診斷具有重要意義，電鏡找到NE顆粒最可靠。由于電鏡標本取材局限，制作周期長，費用高，免疫組織化學NE標記相對是研究NE分化的一種十分實用、敏感和可靠的手段。CgA、Syn是近年來發現的作為診斷NE存在和分布的特異性標志物。本研究選擇SyN、CgA、CD56 這3種神經內分泌標志物共同應用，可以提高NE分化的診斷率，為臨床診斷和治療提供可靠依據。

染色體的多體是癌細胞普遍存在的遺傳學特征之一。因為HER-2基因定位在17號染色體上，17號染色體多體可影響HER-2基因擴增的判讀［3］。17號染色體出現多體時，HER-2基因也同步擴增，從而出現了HERZ基因擴增的假陽性結果，因此檢測HERZ-2基因擴增必須同時有17號染色體作為參考，這樣可以避免17號染色體多體產生的假陽性結果［3］。本研究在胃癌和胃癌伴NED患者的HER-2 DISH檢測結果中均發現HER-2基因/17號染色體共擴增的情況，而且HER-2基因擴增的胃癌NED組出現17號染色體多體的概率比HER-2基因無擴增組更高。DISH檢測HER-2基因狀態時應用不同顏色的熒光信號同時標記了HER-2基因和17號染色體著絲粒，DISH比值法在17號染色體為異倍體時校正了17號染色體拷貝數差異的影響，是比IHC更準確的方法。

目前大量的研究發現，在多種惡性腫瘤中存在HER-2基因的異常擴增，并且與其預后不良有關。HER-2在胃癌發生中起關鍵作用，其擴增率或過表達率為7%～34%，HER-2陽性的胃癌可能預示腫瘤惡性程度高和預后不良［4］。胃癌伴NED患者的術后生存情況，各文獻報道不同。Naritomi等［5］研究發現胃癌伴NED的患者術后生存時間較短，預后差。于紅梅等［6］也得出了相似的結論。但有學者認為胃腺癌中神經內分泌分化細胞雖然可能不是獨立的提示患者預后的因素，但可以在一定程度上影響腫瘤的分級和分期。胃癌伴NED HER-2基因擴增及蛋白表達情況國內外報道較少。本研究發現雖然胃癌伴NED是胃癌的特殊類型，但胃癌伴NED患者的HER-2基因擴增和蛋白表達情況和不伴NED的胃癌相同。HER-2基因擴增的胃癌伴NED患者術后生存期短于不擴增患者，且胃癌伴或不伴NED、HER-2基因是否擴增、淋巴結轉移和手術方式是預后的獨立影響因素。ToGA研究顯示，在歐美國家和日本，曲妥珠單抗聯合化療成為目前治療HER2陽性胃癌患者的最佳選擇［7］。這個結果引起了廣泛關注，使胃癌的靶向治療成為一個新的研究熱點。張小田等［8］也認為曲妥珠單抗聯合化療治療HER2陽性胃癌安全有效，將其應用于二線化療、維持治療亦可能使患者獲益。中國15家研究中心參與的ToGA試驗證實曲妥珠單抗聯合化療可作為HER-2陽性的中國晚期胃或胃食管結合部腺癌新的標準治療［9］。對于胃癌伴NED且HER-2陽性患者使用曲妥珠單抗聯合化療能否作為無法手術的局部進展期或轉移性胃或胃食管結合部腺癌新的治療選擇還需要進一步研究。

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（2014-05-07收稿 2014-11-13修回）

（本文編輯 魏杰）

Roles of HER-2 gene amplification and protein expression in gastric carcinoma with neuroendocrine differentiation

SONG Wei1，YU Qingkai1△，ZHANG Jingjing2，ZHANG Jianbo1，SUN Miaomiao1
1 Department of Pathology，Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Henan 450003，China；2 Department of Car?diology，Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University
△Corresponding Author E-mail：yuqingkai@hotmail.com

Objective To evaluate the gene amplification and protein expression of HER-2 in gastric carcinoma with or without neuroendocrine differentiation（NED），and to explore the difference in HER-2 gene profile between these two neo?plasms.Methods Cases of gastric carcinoma with NED（n=70）and cases of gastric carcinoma without NED（n=150）were retrospectively reviewed.Gene amplification and protein expression of HER-2 genes in gastric carcinoma with or without NED were detected by combination of immunohistochemical method（IHC）and double color silver dye for in situ hybridiza?tion（DISH）.Prognosis of gastric cancer patients with NED were predicted using Kaplan-Meiers survival analysis.Results Expression rates of HER-2 in gastric cancer with and without NED are 20.00%and 21.33%respectively.Amplification of HER-2 in gastric cancer with and without NED are 8.57%and 14.67%respectively.Gene amplification and protein expres?sion of HER-2 between gastric cancer with NED and without NED showed no statistical difference.Chromosome 17 multibody positively correlated with gene HER-2 amplification in Gastric carcinoma with NED.Postoperative survival period in patients of gastric carcinoma with NED and HER-2 amplification was shorter than that in patients of gastric carcinoma with?out NED but with HER-2 amplification.Gastric carcinoma with or without NED，HER-2 gene amplification，lymph node me?tastasis and operation method obviously correlate with prognosis of gastric carcinoma patients（P＜0.05）.Conclusion The gastric cancer with NED is a special type of gastric cancer，there was no difference of gene amplification and protein expres?sion of HER-2 gene between gastric carcinoma with NED and without NED.Poor prognosis would be expected in gastric can?cer patients with NED and HER-2 amplification.

carcinoma，neuroendocrine；stomach neoplasms；proto-oncogene proteins；in situ hybridization；gene am?plification；HER-2；protein expression

R735.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.014

河南省醫學科技攻關項目（2011020159，200803121）；河南省基礎與前沿技術研究項目（102300410038）；河南省公益科研所預研項目（082103810505）

1鄭州大學附屬腫瘤醫院病理科（郵編450003）；2鄭州大學附屬中心醫院心內科

宋魏（1980），女，主治醫師，主要從事腫瘤病理學方面研究

△E-mail:yuqingkai@hotmail.com