一種新的富集并計數肺癌腦膜轉移患者腦脊液中惡性腫瘤細胞的方法

馬春華，姜镕，李金鐸，王斌，孫立偉，呂遠

新技術交流

一種新的富集并計數肺癌腦膜轉移患者腦脊液中惡性腫瘤細胞的方法

馬春華，姜镕△，李金鐸，王斌，孫立偉，呂遠

目的 通過觀察腫瘤標志物免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交技術平臺（TM-iFISH）富集并計數肺癌腦膜轉移患者腦脊液中的惡性腫瘤細胞，探討一種新的檢測腦脊液中惡性腫瘤細胞的方法。方法 選取6例經腦脊液細胞學或頭增強MRI掃描確診的肺癌腦膜轉移患者，每例患者經腰椎穿刺獲取腦脊液20 mL（共10份），其中7.5 mL應用TM-iFISH技術富集并計數腦脊液中的惡性腫瘤細胞，10 mL行腦脊液細胞學檢查，2.5 mL行腦脊液生物化學檢查。結果 10份腦脊液標本均順利完成上述檢測，其中7份標本通過TM-iFISH技術計數示腫瘤細胞數為3～1 823個/7.5 mL腦脊液，3份腦脊液細胞學檢查發現腫瘤細胞，9份腦脊液生物化學檢查結果蛋白量高于正常值。3例患者治療后應用TM-iFISH技術再次計數腦脊液惡性腫瘤細胞，2例患者計數較治療前減少。結論 TM-iFISH技術可以富集并計數肺癌腦膜轉移患者腦脊液中惡性腫瘤細胞，可能成為肺癌腦膜轉移的診斷和療效評價方法。

腦膜；癌，非小細胞肺；腫瘤循環細胞；腦膜轉移；非小細胞肺癌；腦脊液；腫瘤標志物免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交

腦膜轉移癌（leptomeningeal metastasis，LM）是指原發病灶的癌細胞在腦膜和脊髓蛛網膜下隙彌漫性播散或呈局灶浸潤的一種中樞神經系統轉移癌，常繼發于白血病、淋巴瘤、肺癌和乳腺癌［1］。未經治療的腦膜轉移癌患者中位生存期僅4～6周，經綜合治療后，其中位生存期僅能達到3～5個月［2］?，F階段早期診斷腦膜轉移癌仍為醫學難題，主要依據典型中樞神經系統癥狀、腦脊液細胞學檢查和頭部MRI增強掃描進行診斷。然而，超過90%的腦膜轉移瘤患者沒有典型的中樞神經系統的癥狀和體征；首次腦脊液細胞學檢查的陰性率高達45%，第2次腦脊液檢查的陽性率達80%；頭部強化MRI的特異性幾乎能夠達到100%，但存在 65%的假陰性率和 10%的假陽性率［3］。因此，尋找一種更為靈敏的方法來檢測腦膜的潛在轉移是十分必要的。血液循環腫瘤細胞（cir?culating tumor cells，CTCs）即脫落入血的實體腫瘤細胞，與腫瘤轉移、耐藥［4］、預后和復發［5-6］等有明顯關聯性。腫瘤標志物免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交技術平臺（tumor marker immunostaining-FISH，TM-iFISH）通過富集和分析技術可有效鑒別生物體液樣本中各種非血源性腫瘤上皮細胞并進行計數，目前尚鮮見關于用TM-iFISH技術檢測腦脊液中CTCs的文獻報道。本研究中采用TM-iFISH技術檢測10份腦脊液中的CTCs，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年3—9月在我院治療的非小細胞肺癌腦膜轉移患者6例，均為女性，中位年齡57.5歲，原發腫瘤病理類型均為肺腺癌；4例EGFR基因突變、K-Ras基因未突變；1例EGFR和K-Ras基因均未突變；1例基因突變情況未知。主要臨床表現為持續性頭痛（5例）、認知障礙（3例）、視覺障礙（2例）、耳聾（2例）、馬尾綜合征（2例）。5例合并腦實質轉移。符合以下條件：（1）經組織學或細胞學明確診斷的非小細胞肺癌患者。（2）經腦脊液細胞學或影像學明確診斷的肺癌腦膜轉移患者。（3）實驗室檢查結果無腰椎穿刺術禁忌。（4）經脫水藥物治療后顱內高壓癥狀可獲得控制。（5）患者能耐受腰椎穿刺取腦脊液。（6）排除合并腦膜其他病變，如腦膜瘤、室管膜瘤等。（7）簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 TM-iFISH檢測 腰椎穿刺采集患者腦脊液20 mL，其中7.5 mL儲存于TM-iFISH檢測專用試管內，常溫保存，3 d內應用TM-iFISH技術檢測CTCs。（1）免疫磁珠陰性篩選法富集細胞：使用包被抗CD45抗體的免疫磁珠去除CD45陽性的白細胞，將7.5 mL腦脊液制備成100 μL細胞懸液。（2）細胞計數：固定100 μL細胞懸液滴片，分別采用4，6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色（陽性表明捕獲到的細胞為有核細胞）、8號染色體著絲粒探針（CEP8）檢測細胞8號染色體數目、抗細胞角蛋白-18（CK18）抗體染色（陽性表明捕獲到的細胞為上皮來源）和CD45抗體染色（陰性表明捕獲到的細胞為非白細胞）進行免疫熒光分析。OLYMPUS-BX53熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）下進行細胞計數，重復計數5次取平均值作為最終值。10 mL腦脊液行腫瘤細胞學檢查，另2.5 mL行生物化學檢測。

1.2.2 CTCs判斷標準 熒光顯微鏡下藍色通道下觀察DA?PI染色，藍色熒光者表明為有核細胞；橙色通道下觀察CEP8 FISH信號，橙色亮點數目即為8號染色體數目，大多數CTCs 8號染色體呈多倍體，即CEP8陽性，血源性白細胞8號染色體呈二倍體，即CEP8陰性；綠色通道下觀察細胞是否表達CK-18，呈綠色熒光即為陽性；紅色通道下觀察細胞是否表達CD45，呈紅色熒光即為陽性。最后在多通道下再次確認細胞為非血源性上皮細胞來源的腫瘤細胞，即呈DA?PI+、CD45-、CK18+或CK18-、CEP8+；而呈現DAPI+、CD45+、CK18-、CEP8-時，則表明細胞為血源性白細胞。

2 結果

本組6例患者共10份腦脊液標本順利通過TM-iFISH技術平臺檢測，其中 7份腦脊液發現3～1823個/7.5 mL腫瘤細胞，見圖1；3例患者治療后應用TM-iFISH技術再次富集并計數腦脊液中的腫瘤細胞，2例計數較治療前減少，1例治療前后均未能富集并計數到腫瘤細胞。3份腦脊液細胞學檢查采用HE染色發現腫瘤細胞，但該方法不能對腫瘤細胞進行計數。9份腦脊液生物化學檢查結果蛋白量高于正常值。全組患者治療前、后行頭部增強MRI檢查均顯示腦膜轉移征象，但無明顯變化。

Fig.1 Image of enriched cells under fluorescence microscope（×400）圖1 熒光顯微鏡下富集的細胞圖像（×400）

3 討論

腦膜轉移癌是指原發病灶中的腫瘤細胞轉移并彌漫性浸潤軟腦膜、蛛網膜下腔引起腦組織、腦神經和脊髓受損癥狀與體征。目前國內診斷腦膜轉移癌主要采用以下標準：（1）具有明確的腫瘤病史。（2）新發神經系統癥狀與體征。（3）典型的MRI表現。（4）腦脊液細胞學檢查發現腫瘤細胞。凡具備前2項及第3或4項中的任一項即可確診。然而，腦膜轉移癌的臨床表現常因腫瘤細胞侵犯的部位不同而復雜多樣，缺乏特異性，與腦實質、脊髓轉移引起的癥狀以及治療原發腫瘤出現的不良反應很難鑒別［7］。在本研究中，6例患者的主要臨床表現為持續性頭痛（5例）、認知障礙（3例）、視覺障礙（2例）、耳聾（2例）、馬尾綜合征（2例），符合腦膜轉移癌的主要臨床表現。但5例患者合并有腦轉移，全組病例均進行了鞘內化療或靜脈化療。因此臨床上很難對上述癥狀進行鑒別診斷。本研究中9份腦脊液的生物化學檢查提示蛋白含量升高，考慮與腫瘤細胞浸潤腦膜及其代謝產物的化學刺激，造成血腦屏障的破壞和血管通透性增加，導致蛋白滲出增加有關。腦脊液生物化學檢測結果提示腦脊液其檢測敏感度較高，但其缺乏特異性，僅能作為臨床參考的一項指標。在本研究中，6例肺癌腦膜轉移癌患者既往均經腦脊液細胞涂片或頭部強化MRI掃描檢查明確診斷為腦膜轉移癌，但在本研究中僅3份患者腦脊液細胞學檢查發現腫瘤細胞，提示腦脊液細胞學檢查的隨機性較大，且不能計數腫瘤細胞。增強MRI掃描的典型表現為腦膜增厚或伴有結節、腦膜線形或條索樣強化、腦膜彌漫性強化，有時可見“尾征”等直接征象，并伴有腦實質容量變小、腦水腫、腦室周圍水腫等繼發性改變［8］。本組6例患者治療后復查頭部增強MRI掃描均發現腦膜轉移癌的典型征象，但均未提示腦膜轉移范圍存在明顯變化，因此增強MRI掃描很難對腦膜轉移癌進行療效評價。筆者認為腦脊液細胞學檢查及增強MRI掃描在診斷腦膜轉移癌、療效評價方面不能滿足臨床醫師的需要，因此，尋找更靈敏的檢測方式是十分必要的。

腫瘤標志物免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交技術平臺即TM-iFISH，通過富集技術和分析技術在生物體液標本中有效鑒別各種非血源性腫瘤上皮細胞，對鑒別CTCs具有較高的靈敏性和特異性。研究顯示該類技術檢測腦脊液中CTCs，進而診斷乳腺癌［3］、惡性黑色素瘤［9］、肺癌腦膜轉移［10］具有較高的敏感度。本研究中6例患者共10份腦脊液標本均經TM-iFISH檢測富集并計數腫瘤細胞，其中7份腦脊液標本中的腫瘤細胞計數為3～1 823個/7.5 mL。3例患者治療后再次應用TM-iFISH技術檢測腦脊液中的腫瘤細胞，2例患者腫瘤細胞計數較治療前減少，1例患者治療前后均未能富集并計數到腫瘤細胞。腦脊液細胞學檢查發現腫瘤細胞的3份標本，TM-iFISH檢測的腫瘤細胞計數亦高于其余7份標本，二者是否存在相關性尚需進一步研究。本研究結果表明TM-iFISH檢測技術對腦脊液中腫瘤細胞具有較高的敏感度，且可計數腫瘤細胞數，在腦膜轉移癌的診斷和療效評價方面較腦脊液細胞學檢查、增強MRI掃描表現出一定優勢。

［1］Leal T，Chang JE，Mehta M，et al.Leptomeningeal metastasis:chal?lenges in diagnosis and treatment［J］.Curr Cancer Ther Rev，2011，7 （4）：319-327.

［2］Nagpal S，Riess J，Wakelee H.Treatment of leptomeningeal spread of NSCLC：a continuing challenge［J］.Curr Treat Options Oncol，2012，13（4）：491-504.

［3］Emilie Le Rhun，Frédéric Massin，Qian Tu，et al.Development of a new method for identification and quantification in cerebrospinal fluid of malignant cells from breast carcinoma leptomeningeal me?tastasis［J］.BMC Clinical Pathology，2012，12:21.

［4］Igawa S，Gohda K，Fukui T，et al.Circulating tumor cells as a prog?nostic factor in patients with small cell lung cancer［J］.Oncol Lett，2014，7（5）:1469-1473.

［5］Yu Y，Chen ZL，Dong JS，et al.Folate receptor-positive circulating tumor cells as a novel diagnostic biomarker in non-small cell lung cancer［J］.Transl Oncol，2013，6（6）:697-702.

［6］Romiti A，Raffa S，Di Rocco R，et al.Circulating tumor cells count predicts survival in colorectal cancer patients［J］.J Gastrointestin Liver Dis，2014，23（3）:279-284.

［7］Ma CH，Jiang R，Li JD，et al.Research progress of lung cancer with leptomeningeal metastasis［J］.Chinese Journal of Lung Cancer，2014，17（9）:695-700.［馬春華，姜镕，李金鐸，等.肺癌腦膜轉移的研究進展［J］.中國肺癌雜志，2014，17（9）:695-700］.

［8］Clarke JL，Perez HR，Jacks LM，et al.Leptomeningeal metastases in the MRI era［J］.Neurology，2010，74（18）:1449-1454.

［9］Le Rhun E，Tu Q，De Carvalho Bittencourt M，et al.Detection and quantification of CSF malignant cells by the cell search technology in patients with melanoma leptomeningeal metastasis［J］.Med Oncol，2013，30（2）:538.

［10］Jiang R，Ma CH，Zhu ZL，et al.Application of detecting cerebrospi?nal fluid circulating tumor cells in the diagnosis of meningeal metas?tasis of non-small cell lung cancer［J］.Chin J Contemp Neurol Neuro?surg，2014，14（8）:704-707.［姜镕，馬春華，朱子龍，等.腦脊液循環腫瘤細胞檢測在非小細胞肺癌腦膜轉移診斷中的應用［J］.中國現代神經疾病雜志，2014，14（8）:704-707］.

（2014-10-28收稿 2014-11-27修回）

（本文編輯 閆娟）

A novel methodology to concentrate and quantify malignant cells in CSF from lung cancer patients with leptomeningeal metastasis

MA Chunhua，JIANG Rong△，LI Jinduo，WANG Bin，SUN Liwei，LYU Yuan
Department of Intervention，Tianjin HuanHu Hospital，Tianjin Key Laboratory of Cerebral Vascular and Neurodegenerative Disease，Tianjin 300060，China
△Corresponding Author E-mail：jiangrong1989@sina.com

Objective To assess the value of tumor marker immunostaining-FISH（TM-iFISH）technology on concen?trating and enumeration of tumor cells in CSF of lung cancer patients with leptomeningeal metastasis（LM）.Methods Six cases of non-small cell lung cancer with leptomeningeal metastasis，which were diagnosed by CSF cytology or enhanced MRI scan，were selected.A total of 20 mL of CSF was collected in each case.TM-iFISH technology was employed to concen?trate and quantify circulating tumor cells in 7.5 mL CSF samples in each case while CSF cytology used 10 mL CSF samples in each case；Finally，the rest 2.5 mL CSF in each case was used for biochemistry assay.Results Ten CSF samples from 6 patients with non-small lung cancer with LM were assayed and tumor cells numbers ranging between 3 and 1 823 every 7.5 mL were found in 7 samples.On the other hand，CSF cytology examination only revealed tumor cells in 3 cases.Using CSF biochemical assay，higher than normal of protein level was found in 9 cases.TM-iFISH technology was employed again in 3 cases of patients who received treatment.Tumor cell count in CSF reduced in 2 out of the 3 cases.Conclusion TM-iFISH technology is a new method for detection and enumeration of tumor cells in the CSF in non-small cell lung cancer patients with leptomeningeal metastasis.This technology present diagnosis and curative values in lung cancer patients with leptomen?ingeal metastasis.

meninges；carcinoma，non-small-cell lung；neoplasm circulating cells；leptomeningeal metastasis；nonsmall cell lung cancer；cerebrospinal fluid；tumor marker immunostaining-FISH

R742

B

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.023

天津市衛生局科技基金資助項目（2014KZ042）

天津市環湖醫院腫瘤介入科，天津市腦血管與神經變性重點實驗室（郵編300060）

馬春華（1981），男，碩士，主治醫師，主要從事腫瘤介入化療研究

△E-mail:jiangrong1989@sina.com