細胞外組蛋白在酸吸入性急性肺損傷發病中的作用研究

張雁林 毛麗君 李樹強 陳明 郭利霞 趙贊梅 關里 溫韜 趙金垣

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.004

基金項目：國家自然科學基金（30571551，81241060）

作者單位：100191 北京，北京大學第三醫院職業醫學研究中心（張雁林、毛麗君、李樹強、陳明、郭利霞、趙贊梅、關里、趙金垣）;首都醫科大學附屬北京佑安醫院北京市肝病研究所（溫韜）

通信作者：趙金垣，Email：zhaojinyuan@sina.com

【摘要】目的 研究細胞外組蛋白是否是鹽酸吸入性急性肺損傷（ALI）發病過程中的重要炎癥介質，是否可作為干預的靶標。 方法 選取生理鹽水和4個濃度的鹽酸（0.01、0.1、0.3和0.5 mol/L）來研究小鼠吸入鹽酸與血漿組蛋白水平的相關性;選取吸入鹽酸后共6個時間點（1、3、6、12、24和72 h）觀察組蛋白的變化規律;采用抗組蛋白中和抗體研究特異拮抗組蛋白對小鼠病死率、血氣分析、肺水腫、肺組織MPO活力、肺病理的影響。結果 小鼠吸入鹽酸后血漿中組蛋白水平明顯升高，而且吸入鹽酸濃度與血漿中組蛋白H4水平具有明顯的正相關性（r=0.874 6， P=0.031 7） ?？菇M蛋白H4中和抗體可減少病死率（P=0.034 5），血氣分析結果有所改善，肺水腫、肺組織髓過氧化物酶（MPO）活力、肺組織病理均有改變。結論 細胞外組蛋白是一種新的內源性炎性介質，在介導酸吸入性ALI中起重要作用;它既可作為反映損傷嚴重程度的指標，還可作為干預治療的靶標。

【關鍵詞】細胞外組蛋白;急性肺損傷;酸吸入;炎癥;中和抗體

Study in the role of extracellular histones in the pathogenesis of acute lung injury caused by acid aspiration

Zhang Yanlin， Mao Lijun， Li Shuqiang， Chen Ming， Guo Lixia， Zhao Zanmei， Guan Li， Wen Tao， Zhao Jinyuan.

Research Center of Occupational Medicine， Third Hospital of Peking University， Beijing 100191， China

Corresponding author：Zhao Jinyuan，Email：zhaojinyuan@sina.com

【Abstract】Objective To investigate the effects of extracellular histones as a major mediator and the target for intervention in the pathogenesis of ALI in the wake of acid aspiration. Methods The correlation of circulating histones and aspiratory acid was determined with normal saline and 4 different concentrations of acid （0.01 mol/L，0.1 mol/L，0.3 mol/L and 0.5 mol/L）. The dynamic change of circulating histones was observed at 6 intervals of 1，3，6，12，24 and 72 h after injury. The protection of anti-histone-4 antibody was assessed by survival rates， blood gas， lung edema， MPO activity and lung pathological change.Results After acid aspiration， extracellular histone H4 increased significantly. The circulating histone levels were closely correlative with the concentrations of aspiratory acid（r=0.874 6， P=0.031 7）. The anti-histone-4 antibody could decrease mortality （P=0.034 5） and improve blood gas， lung edema， MPO activity and lung pathological change. Conclusions The results showed that extracellular histones were not only the key mediators in the pathogenesis of ALI but also the target for intervention.

【Key words】Extracellular histones;Acute lung injury;Acid aspiration;Inflammation;Neutralizing antibody

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/ 急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS） 是以肺毛細血管內皮細胞通透性增加所致的非心源性滲透性肺水腫和頑固性低氧血癥為特點的臨床綜合征[1-2]。ARDS屬于ALI的終末階段， 是重癥監護病房的主要致死原因，多數文獻報道其病死率高達40 %左右。ALI的主要病因包括感染、酸吸入以及嚴重創傷[3-4]。職業性化學性毒物吸入同樣是ALI的重要病因，如氯氣、氨氣、火災中的煙霧等[5]。

目前對于ALI/ARDS的預防和治療，還沒有特效的手段，主要治療策略集中在機械通氣上。居高不下的病死率提示目前對ARDS的發病機制仍不十分清楚，以致治療針對性不強[6-7]。因此深入研究ALI/ARDS的發病機制尤其是核心啟動環節是重中之重。

研究發現，細胞凋亡或壞死時染色質發生降解，釋放核小體入外周血，核小體再分解為組蛋白和DNA，少量組蛋白可迅速被單核巨噬細胞清除。但在嚴重損傷情況下，死亡細胞釋放大量組蛋白，超過了機體的清除能力，過剩的細胞外組蛋白便會作為內源性損傷相關分子（damage-associated molecular pattern， DAMP）啟動炎癥反應導致進一步的損傷[8-10]。Xu等[11]研究表明，在小鼠感染模型中，組蛋白是導致細胞損傷和器官功能障礙的主要介質，而且直接給小鼠注射組蛋白即可致死;而給予抗組蛋白特異抗體則有明顯的保護作用，其中起關鍵作用的是組蛋白H4。Abrams等[12]研究證實在創傷患者血漿中的組蛋白濃度與創傷損傷程度有明顯的正相關性，組蛋白可引起遠隔部位器官的損傷，以肺損傷最常見。以上研究顯示細胞外組蛋白是重要的炎癥介質，在ALI等炎癥性疾病的發生、發展中具有關鍵作用[13]。

本課題以鹽酸吸入引起的ALI小鼠模型為實驗對象，研究組蛋白在ALI發病過程中的變化規律以及與肺損傷程度的相關性，并且采用特異性抗組蛋白抗體進行干預，以探討組蛋白是否是酸吸入性ALI的重要炎癥介質。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

本研究中所有的動物實驗均得到北京大學醫學部動物管理和應用委員會的許可。健康6～8周齡的成年雄性C57BL/6小鼠 （體質量18～20 g） 購自北京大學醫學部實驗動物中心， 在實驗前飼養3 d使動物適應環境，給予小鼠飼料并自由飲水。分析純鹽酸購自北京化工廠。羊抗小鼠組蛋白H4多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;組蛋白H4檢測試劑盒（ELISA法）購自武漢浩軒凱文生物技術公司;蛋白定量試劑盒（Bicinchoninic Acid，BCA法）購自美國Sigma公司;髓過氧化物酶 （myeloperoxidase， MPO） 檢測試劑盒購自南京建成生物公司;特異性抗組蛋白H4中和抗體（anti-H4）由北京佑安醫院溫韜博士惠贈，非特異性的IgG抗體用作對照。

1.2 模型制備和動物分組

實驗前小鼠禁食12 h但不禁水，用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，將小鼠保持在60°的頭高位，用9號注射針在環狀軟骨部位穿刺氣管緩慢注射鹽酸 （2 mL/kg 體質量），時間不少于30 s以防窒息;對照組僅注射等量生理鹽水[14]。根據預實驗結果，選取生理鹽水、0.01、0.1、0.3和0.5 mol/L鹽酸5個濃度水平檢測酸吸入性ALI血漿中的組蛋白濃度;選取注射后1、3、6、12、24和72 h共6個時間點觀察血漿中的組蛋白質量濃度變化。每組動物6只，在設定的時間點取標本檢測。

1.3 血漿中組蛋白含量測定

ELISA方法：在設定的時間點，用枸櫞酸鈉抗凝的注射器穿刺小鼠腹主動脈取血，經低速離心后分離血漿，采用ELISA試劑盒檢測血漿中組蛋白H4的濃度。Western blot方法：用蛋白檢測試劑盒（BCA法）測定血漿中蛋白含量，等量的血漿蛋白（100 μg）與載樣緩沖液混合后，加入12% （w/v） SDS-聚丙烯酰胺凝膠后電泳，用吸光度法測定蛋白條帶的相對亮度。

1.4 血氣分析

插入肝素化的腹主動脈導管取小鼠頸動脈血0.3 mL，在37 ℃條件下用Ciba Corning-170型血氣分析儀進行檢測。

1.5 肺組織MPO活性檢測

實驗程序結束后，迅速取下小鼠的左下肺葉，加入生理鹽水進行勻漿并離心，取上清液。加入MPO檢測試劑，用1601型紫外-可見分光光度計（Shimadzu， Japan） 在460 nm波長進行檢測。

1.6 肺濕質量/干質量的比值的檢測

實驗程序結束后，迅速取下小鼠的右上肺葉，用生理鹽水沖洗除去黏有的血污，再用組織試紙吸去附著的生理鹽水，稱濕質量。然后把標本放在60 ℃的恒溫干燥箱中72 h，稱干質量。肺濕質量/干質量的比值作為肺水腫程度的指標。

1.7 肺組織病理學檢測

取自小鼠右下肺葉的組織浸泡在10%甲醛溶液中24 h，用石蠟包埋，切成4 μm的切片，經HE染色。根據下列情況對顯微鏡下的損傷評分[15]：出血、間質水腫、壞死、中性粒細胞浸潤和肺膨脹不全。肺損傷的嚴重程度依據以下標準判斷：基本無損傷，0分;損傷區域小于25%，1分;損傷區域小于50%，2分;損傷區域小于75%，3分;彌漫性損傷，4分。每張病理切片隨機選取3個顯微視野。

1.8 統計學方法

計量資料用均數±標準差（x±s）表示?？傮w的組間差異用方差分析計算，與同一組比較采用Dunnet-t檢驗，組內兩組間的比較用Student-Newman-Keuls計算。動物生存分析用log-rank檢驗，相關分析用Pearson檢驗（GraphPad Software， V5）。以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

在劑量-反應實驗中，筆者發現鹽酸吸入濃度可直接影響小鼠肺損傷程度：0.01 mol/L濃度組損傷輕微，小鼠均存活;0.1 mol/L濃度組出現明顯的呼吸困難如呼吸急促、皮膚發紺，有2只小鼠于24 h死亡;0.3 mol/L濃度組損傷嚴重，5只小鼠于24 h內死亡;0.5 mol/L濃度組損傷最重，全部6只小鼠均于24 h內死亡。

2.2 小鼠酸吸入后血漿中的細胞外組蛋白變化

如圖1A所示，小鼠吸入鹽酸后1 h，血漿中組蛋白H4濃度開始增加，在3～6 h明顯升高，在約12 h達到峰值，以后逐漸下降，72 h仍高于正常范圍。與對照組相比，小鼠吸入鹽酸3、6、12 h后，血漿中組蛋白H4濃度升高差異有統計學意義（P<0.01）;吸入鹽酸24 h后，仍差異有統計學意義（P<0.05）;而吸入鹽酸1 h和72 h后，血漿中組蛋白H4濃度雖升高但差異無統計學意義。小鼠血漿中組蛋白的變化除用ELISA方法檢測外，Western blot同樣證實血漿中組蛋白的上述變化規律（圖1B）。而且小鼠吸入鹽酸的濃度越高，血中組蛋白H4的濃度越高，二者具有明顯的正相關性（圖1C）。在0.01 mol/L至0.5 mol/L濃度范圍內，血漿中組蛋白水平與吸入鹽酸濃度的相關系數r為0.874 6， 具有統計學意義（P=0.031 7） 。

2.3 抗組蛋白H4抗體對致死濃度鹽酸吸入病死率的影響

小鼠吸入致死濃度鹽酸（0.3 mol/L， 2 mL/kg）后出現明顯的呼吸窘迫癥狀，未經干預的小鼠在24 h內全部死亡。而在酸吸入損傷前，經尾靜脈注射給予anti-H4中和抗體預處理可降低病死率，小劑量（2.5～5 mg/kg）中和抗體保護作用不明顯（結果未顯示），大劑量中和抗體（10～20 mg/kg）可明顯降低病死率（與對照抗體組相比，P=0.034 5）。但是無中和作用的對照抗體IgG在小劑量和大劑量時均無保護作用（圖2）。以上結果提示anti-H4中和抗體可通過拮抗炎癥介質組蛋白來減輕損傷程度，從而減少致死濃度鹽酸吸入引起的病死率。

2.4 Anti-H4中和抗體對酸吸入性ALI血氣的影響

小鼠吸入致傷濃度鹽酸（0.1 mol/L， 2 mL/kg）后（常壓下FiO₂為21%），動脈血氧分壓（PaO₂）明顯下降[38～61 mmHg，（52.6±8.7）mmHg]，達到ALI（PaO₂/FiO₂<300 mmHg）乃至ARDS（PaO₂/FiO₂<200 mmHg）標準（1 mmHg=0.133 kPa）。而給予anti-H4中和抗體預處理，可改善PaO₂，小劑量（2.5～5 mg/kg）效果較弱，大劑量（10～20 mg/kg）效果較明顯（P<0.05）;但是無中和作用的對照抗體IgG在小劑量和大劑量時均無保護作用（圖3）。小鼠吸入鹽酸后，動脈血二氧化碳分壓（PaCO₂）升高不明顯，與小鼠呼吸頻率增快、加速CO₂排出有關;動脈血pH值降低至（7.23±0.11），與缺氧導致的代謝性酸中毒有關（具體數值未列出）。

2.5 Anti-H4中和抗體對酸吸入性ALI肺水腫的作用

小鼠吸入致傷濃度鹽酸（0.1 mol/L， 2 mL/kg）后，肺水腫明顯，表現為肺濕質量/干質量比值顯著增加。給予anti-H4中和抗體預處理，可改善肺水腫程度，小劑量（2.5～5 mg/kg）效果不明顯，大劑量（10～20 mg/kg）效果明顯（P<0.05）;但是無中和作用的對照抗體IgG無保護作用（圖4）。

2.6 Anti-H4中和抗體對ALI肺組織中性粒細胞MPO活性的影響

小鼠吸入致傷濃度鹽酸（0.1 mol/L， 2 mL/kg）后，激活了機體炎癥反應，表現為中性粒細胞MPO活性顯著增加。而給予Anti-H4中和抗體預處理，可減輕炎癥反應，小劑量（2.5 mg/kg）效果較差，5～10 mg/kg劑量已有較強的抗炎效果 （P<0.05），而大劑量（20 mg/kg）效果明顯（P<0.01）;無中和作用的對照抗體IgG無保護作用（圖5）。

2.7 Anti-H4中和抗體對酸吸入肺組織病理改變的影響

鹽酸吸入（0.1 mol/L， 2 mL/kg）后1 h，肺組織病理切片可見肺內炎癥細胞浸潤， 肺泡間隔增寬， 點狀出血，肺泡上皮細胞和血管內皮細胞腫脹;在12～24 h最為嚴重，可見大量炎癥細胞浸潤，小片狀或灶狀出血，肺水腫明顯，肺泡內大量纖維蛋白滲出。給予anti-H4中和抗體預處理，可改善病理表現，小劑量效果較弱，大劑量（10～20 mg/kg）效果較明顯;對照抗體IgG無保護作用（圖6）。

3 討論

化學毒物吸入是ALI的主要病因之一，可通過直接和間接效應導致肺和全身臟器損傷。毒物吸入氣道造成的肺損傷可分為兩個時相，第一時相是毒物直接對肺泡上皮毛細血管膜的損傷，即時發生，損傷范圍有限;第二時相則是由第一時相損傷引起的廣泛且持續的炎性損傷，其核心即失控的炎癥反應，涉及全身器官，而且存在正反饋加劇惡化，能產生多器官系統功能障礙乃至死亡等嚴重后果[16]。在第二時相損傷過程中，內源性炎癥介質無疑是損傷發生的關鍵，細胞外組蛋白即是其中重要的一員。

組蛋白是真核生物染色質的基本結構蛋白，在進化中高度保守。組蛋白主要包括5種類型： H1、H2A、H2B、H3 和H4，后4種組蛋白組成八聚體結構，和外周環繞的雙螺旋DNA 片段結合成組蛋白-DNA 復合物，即核小體（nucleosome） 。

本文以鹽酸吸入引起的ALI模型為實驗對象，研究組蛋白在ALI發病過程中的變化規律以及與肺損傷程度的相關性，并且采用特異性抗組蛋白抗體進行干預。研究結果顯示小鼠吸入鹽酸后1 h，血漿中組蛋白H4濃度明顯增加，在約12 h達到峰值，以后逐漸下降，72 h仍高于正常范圍。而且小鼠吸入鹽酸的濃度越高，血中組蛋白H4的濃度越高，二者具有明顯的正相關性。Anti-H4中和抗體可減少致死濃度鹽酸吸入的病死率，同時對血氣分析、肺水腫、炎癥細胞MPO活力、肺組織病理有明顯改善作用。小劑量（2.5～5 mg/kg）時中和抗體保護作用較弱，大劑量（10～20 mg/kg）效果較明顯。但是無中和作用的對照抗體IgG在小劑量和大劑量時均無保護作用。以上結果提示anti-H4中和抗體可通過拮抗組蛋白這種炎癥介質來抑制失控的炎癥反應，從而減輕組織、器官損傷程度，最終降低鹽酸吸入引起的病死率。

細胞外組蛋白在損傷中明顯升高，與致傷因素和損傷程度有良好的相關性;而且針對細胞外組蛋白給予干預，可減輕炎癥損傷?？梢?，細胞外組蛋白是一種重要的內源性炎癥致傷介質，在啟動和加重炎癥性損傷反應中起重要作用。細胞外組蛋白不僅可作為反映疾病嚴重程度的標志物，還可作為抗體或藥物的分子標靶用于臨床干預治療，為ALI/ARDS的防治提供了新的手段。

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（收稿日期：2014-09-30）

（本文編輯：鄭辛甜）

P247-252