脂氧素抑制內毒素誘導大鼠原代肺成纖維細胞環氧合酶—2及前列腺素E₂的表達

朱天琦 鄭聲星 葉綠 唐乾

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.005

基金項目：國家自然科學青年基金（81401579）

作者單位：325000 浙江省溫州， 溫州醫科大學附屬第一醫院麻醉科（朱天琦）;溫州醫科大學附屬第二醫院麻醉科（鄭聲星、葉綠 、唐乾）

通信作者：朱天琦，Email： skytiantian_1234@163.com

【摘要】目的 探討脂氧素對大鼠原代肺成纖維細胞環氧合酶-2及前列腺素E₂表達的影響。方法 分離、純化、鑒定得到大鼠肺成纖維細胞，用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）干預建立成纖維細胞體外急性炎癥模型，并利用細胞增殖/毒性檢測試劑MTT摸索出成纖維細胞急性炎癥模型的最適LPS質量濃度和藥物干預時間。分別應用不同濃度（0、100、200、400 nmol/mL） 的脂氧素作用于經過LPS誘導的體外培養原代肺成纖維細胞。采用酶聯免疫法（ELISA）檢測細胞上清液前列腺素E₂（PGE₂）水平， 同時應用Western blot檢測原代肺成纖維細胞環氧合酶（COX-2）蛋白的表達。結果 用1 μg/mL LPS干預體外培養的原代肺成纖維細胞6 h能建立較為合理的急性炎癥模型。脂氧素能抑制LPS誘導的原代肺成纖維細胞環氧合酶（COX-2）蛋白的表達。對照組、LPS組、LPS組與LPS+脂氧素組測PGE₂質量濃度分別為55.84 pg/mL、411.73 pg/mL、307.07 pg/mL，LPS組與LPS+脂氧素組間比較差異有統計學意義（P<0.01）。結論 脂氧素能抑制LPS誘導的原代肺成纖維細胞環氧合酶-2及前列腺素E₂的表達，并呈劑量依賴性。

【關鍵詞】脂氧素;內毒素;肺成纖維細胞;環加氧酶-2;脂多糖類

LipoxinA4 reduces lipopolysaccharide-induced expression of cyclooxygenase-2 and prostaglandin E₂in primary lung fibroblasts of rat Zhu Tianqi， Zheng Shengxing， Ye Lü， Tang Qian.Department of Anesthesia，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China

Corresponding author：Zhu Tianqi，Email： skytiantian_1234@163.com

【Abstract】Objective To explore the effects of lipoxinA4 on expression of cyclooxygenase-2 （COX-2） and prostaglandin E₂（PGE₂） in rat primary lung fibroblast cells （LF） after lipopolysaccharide （LPS） challenge. Methods Primary lung fibroblast cells were incubated with various concentrations （0.1，1，10 μg /mL） of LPS for different lengths of time （3，6，9 h）. Then primary lung fibroblast cells were still incubated in DMEM medium containing LPS in the presence or absence of lipoxinA4. After incubation， the supernatant of medium was collected and the level of PGE₂was detected by using ELISA. The cells were harvested， and COX-2 protein was analyzed by Western blot.Results The model of acute inflammation in fibroblasts was well established by administering 1 μg/mL LPS in fibroblasts for 6 hours. Induction of COX-2 protein by LPS was inhibited by lipoxinA4. The levels of PGE₂in control group， LPS group and LPS+LipoxinA4 group were 55.84 pg/mL， 411.73 pg/mL and 307.07 pg/mL， respectively， and there was a significant difference between LPS group and LPS+LipoxinA4 group （P<0.01）. Conclusion LipoxinA4 down-regulates the expression of the COX-2 induced by LPS in primary lung fibroblast cells and consequently inhibits the production of PGE₂in a dose dependent manner.

【Key words】LipoxinA4;Lipopolysaccharide;Lung fibroblast cells;Cyclooxygenase-2;Lipopoly-saccharides

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床常見的危重病，其病死率達35%～58%[1]，內毒素血癥引起的ARDS極為常見。傳統觀念認為急性炎癥效應細胞主要有白細胞及巨噬細胞等，目前越來越多證據表明肺成纖維細胞不僅作為肺組織間質環境的主要組成部分[2]，也可以作為急性炎癥效應細胞，并能分泌促炎癥介質及細胞因子如前列腺素E₂（PGE₂）、白細胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，同時還能表達環氧合酶-2（cyclooxygenase-2 ， COX-2）[3]。環氧合酶-2 是合成前列腺素（如前列腺素E₂）的關鍵限速酶，在急性炎癥時受多種炎癥介質（如細胞因子）刺激而大量表達[4]。在肺部炎癥中也存在環加氧酶-2以及前列腺素E₂的高表達[4]。

脂氧素（lipoxin， LX）是一類重要的內源性脂質抗炎介質。脂氧素是花生四烯酸（arachidonicacid，AA）脂加氧酶（lipoxygenase）代謝產物 ， 由5-脂加氧酶與15-脂加氧酶或者由5-脂加氧酶與12-脂加氧酶作用而形成[5]，主要通過跨細胞途徑來合成 ，在炎癥反應中發揮廣泛的抗炎促消退作用[6]。

本研究用不同劑量的脂多糖（lipopoly-saccharide， LPS）刺激體外培養的原代肺成纖維細胞， 建立較為合理的體外成纖維細胞急性炎癥模型。另外，筆者還在脂氧素對原代肺成纖維細胞在內毒素直接刺激下COX-2及PGE₂表達的影響方面進行研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

脂氧素A4購于Cayman 公司，新生牛血清（FCS）（美國GIBCO公司），DMEM培養基（美國GIBCO公司），內毒素（LPS，E.coil serotype 055：B5），MTT為 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽購自美國sigma公司， 兔抗人COX-2抗體，鼠抗人vimentin（波形但蛋白） 單克隆抗體和鼠抗人CD31 單克隆抗體均購自abcam公司。辣根酶標記山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購于北京中杉公司。PGE₂ELISA試劑盒購于R&D公司，Triton X-100和BCA蛋白測定試劑盒購于Pierce公司，以上公司均為公司原產地國家。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肺成纖維細胞分離和培養 參照Tamm等[7]的組織貼壁的方法并進行改良，大鼠稱質量，腹腔注射2%戊巴比妥鈉80 mg/kg麻醉，仰臥位固定。沿腹中線剪開皮膚，皮下組織，暴露腹腔，切斷腹主動脈放血，剪掉橫膈膜，暴露胸腔，截取胸骨，小心折斷肋骨，摘除胸腺，最大限度地暴露心臟及大血管，從右心室插入套管至肺動脈，用D-Hanks液灌洗至肺明顯發白，完整的取出心肺氣管，除去心臟和大氣道，置于放有預冷的D-Hanks（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U /mL）的無菌培養皿中，反復用預冷的D-Hanks液沖洗，用小剪刀將肺組織剪碎（<1 mm³） ， 移至10 mL離心管中， 靜置5 min后，吸去D-Hanks液后加入0.25%胰蛋白酶（37 ℃預溫）5 mL，用吸管反復吹打1.5 min，加入含15%NBS的H-DMEM培養液終止消化，用吸管吹打均勻，1000 r/min離心5 min，棄上清液，再加入少量15%NBS H-DMEM懸浮組織塊， 加入培養液以不飄起組織塊為宜。每只大鼠肺可接種一個25 mL的培養瓶。37 ℃、 5%CO₂培養箱培養，24 h補加培養液后繼續培養，72 h換液。4 d細胞接近融合時，棄去培養液，D-Hanks液輕洗3次，加入0.25%胰酶消化1 min，用含15%NBS的 H-DMEM培養液終止消化，吸管輕輕吹打細胞，收集細胞懸液，1000 r/min離心2 min，棄上清液，用15% NBS的H-DMEM培養液，按1∶2接種傳代，40 min后換培養液（差速貼壁法）。

1.2.2 HE染色 將養于培養皿里原代的LF細胞，吸棄上清液，加95%乙醇40 min，加入蘇木素15 min染核，自來水洗一遍，0.1%鹽酸乙醇分化1 min，再用自來水洗一遍，溫水返藍1 min，最后伊紅染5 min，倒置顯微鏡下觀察，如圖1A。將經傳代的LF細胞消化制成單個細胞懸液， 計數細胞， 調整細胞密度為 1× 10⁴/mL ，接種于24孔板，置于37 ℃5% CO₂培養箱培養24 h，吸棄上清液，加95%乙醇40 min，加入蘇木素15 min染核，自來水洗一遍，0.1%鹽酸乙醇分化1 min，再用自來水洗一遍，溫水返藍1 min，最后伊紅染5 min，倒置顯微鏡下觀察，如圖1B。

1.2.3 免疫熒光鑒定 將傳代的 LF細胞消化制成單個細胞懸液，計數細胞，調整細胞密度為1×10⁴個/mL，接種于6孔板內（孔內有預先置有多聚賴氨酸涂布的蓋玻片），37 ℃ 5%CO₂培養箱常規培養。當細胞鋪滿蓋玻片時，取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3次，含0.2%Triton的PBS洗兩次，再PBS洗兩次，5%BSA封閉40 min（室溫），保持濕度一抗孵育過夜（4 ℃），次日用PBS洗三次，每次5 min，加二抗（避光）室溫孵育1 h，PBS洗7次，每次5 min，Hoechest復染核12 min，PBS洗一次，檢測LF vimentin和CD31的表達。

1.2.4 實驗分組 實驗分三大組： （1）正常對照組：不給予任何處理;（2）LPS處理組：不同時間點（3、6、9 h）給予不同質量濃度LPS（0.1、1.0、10 μg/mL）;（3）脂氧素LPS組：給予不同濃度（0 nmol/mL、100 nmol/mL）脂氧素加上LPS（1 μg/mL）刺激6 h。藥物刺激前均無血清DMEM培養基培養24 h。

1.2.5 經典細胞增殖/毒性檢測試驗（MTT） MTT[8]法實驗步驟：將分離純化的LF用含15%NBS得培養液配成單個細胞懸液，接種入6孔板，2 mL/孔，37 ℃5%CO₂培養箱培養，待細胞80%～90%呈融合狀態時，換無血清培養基培養24 h后重懸，調整密度為1×10⁶個/mL，加入96孔板，100 μL/孔，5復孔，同時設空白對照孔（不加細胞），加入不同質量濃度LPS作為刺激物，建立體外炎癥模型，同時以PBS作為陰性對照。藥物干預時間設三個，分別為3、6、9 h，至規定時間后加入MTT試劑，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配制，pH=7.4）20 μL。繼續于37 ℃，CO₂培養箱培養孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加150 μL DMSO，震蕩10 min，使結晶物充分融解。放入酶標儀檢測，測定波長490 nm各孔的吸光度值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.6 酶聯免疫法（ELISA）方法檢測細胞上清液中PGE₂的含量 LPS或（及）脂氧素作用結束后收集細胞上清液，2000 r/min離心5 min后待測。酶標板各孔加入細胞上清液50 μL， 37 ℃包被2 h。棄包被液，應用洗滌液洗滌5 min×5次，加入HRP標記的鼠抗人IgG，37 ℃、1 h，洗滌液洗滌5 min×5次，加入TMB顯色液室溫下避光10 min，加入終止液終止反應，酶標儀檢測450 nm吸光度（A）值，應用洗滌液替代樣品為陰性對照組。各孔檢測的吸光度值減去陰性對照組的吸光度值為各孔實際吸光度值，間接反映上清液中PGE₂的含量。

1.2.7 Western-blot檢測COX-2蛋白的表達 取1 μg/mL LPS合并不同濃度脂氧素誘導培養6 h后的肺成纖維細胞，加入適量細胞裂解液，冰上孵育40 min，12 000 r/min離心20 min，上清液即為總蛋白。將總蛋白進行SDS PAGE凝膠電泳，然后電轉移至NC膜上。把膜放入含5 g脫脂奶粉的TBST（10 mmol/L Tris pH 7.5，100 mmol/L NaCl，0.1% Tween20）中室溫封閉1 h，加入兔抗人COX-2和小鼠抗人β-actin多克隆抗體（COX-2以1∶500稀釋，β-actin以1∶1000稀釋）4 ℃搖動過夜。次日用TBST于室溫下洗膜3次，每次15 min，接著加入辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體（1∶2000稀釋）及山羊抗小鼠IgG抗體（1∶2000稀釋），在室溫下輕輕搖動1 h，然后用TBST室溫下洗膜3次，每次15 min。最后用化學發光法曝光顯跡，按化學發光顯影試劑盒（ECL）說明要求加ECL試劑，室溫下溫育2 min后對X線片曝光。

1.3 統計學方法

計量資料以均數±標準差（x±s）表示，以SPSS 16.0統計軟件進行分析處理，多組樣本均數比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因數方差分析。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進行Dunnets T3檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺成纖維細胞純化及鑒定

24 h后顯微鏡下可見長梭型細胞從組織塊中爬出，72 h后細胞生長迅速，4 d接近融合。在原代培養過程中，LF還混有少量的圓形Ⅱ型肺泡上皮（AECⅡ）（圖1 A1）， 因為傳代后差異貼壁利用成纖維細胞貼壁的時間早于ATⅡ細胞，從而去除ATⅡ細胞。LF呈星狀或梭形，核橢圓形，核仁明顯，細胞伸出多個突起，并連接成網狀（圖 1A2）。傳代后的LF幾乎長滿整個培養瓶，偶見其他非纖維細胞，細胞增殖能力強，3 d接近融合，連續傳4～5代以后，細胞增殖能力方逐漸下降。免疫熒光檢測肺成纖維細胞呈vimentin陽性，CD31陰性（圖1B）。

2.2 MTT檢測結果

由表1可以看出，在LPS的刺激下，大鼠肺成纖維細胞出現了增殖反應，三個濃度梯度組與對照組相比，均出現了增殖反應（P<0.01）。其中刺激質量濃度為1 μg/mL 時，與其他三個實驗組相比，細胞增殖反應最大（P<0.01），且在各個濃度的不同刺激時間里，6 h時，細胞增殖反應較大（P<0.05），因此可以確定LPS刺激致ARDS模型的最適刺激質量濃度為1 μg/mL，最佳刺激時間為6 h。

2.3 脂氧素對于LPS刺激肺成纖維細胞COX₂蛋白表達的影響

正常肺成纖維細胞中COX-2蛋白有微量表達，脂氧素抑制LPS刺激肺成纖維細胞的COX-2蛋白表達，LPS組與LPS+脂氧素組間比較差異有統計學意義（P<0.01）。COX-2 蛋白表達結果以COX-2/β-actin吸光度的相對值計算（圖2）。

2.4 脂氧素對于LPS刺激肺成纖維細胞上清液PGE₂含量的影響

脂氧素能抑制肺成纖維細胞環加氧酶-2（COX-2）表達，因此推測脂氧素是否也能抑制其產物前列腺素E₂的表達，肺成纖維細胞上清液ELISA檢測發現，脂氧素能抑制LPS刺激后肺成纖維細胞上清液中PGE₂的含量。對照組，LPS組，LPS組與LPS+脂氧素組測PGE₂質量濃度分別為55.84 pg/mL、411.73 pg/mL、307.07 pg/mL。LPS組與LPS+脂氧素組間比較差異有統計學意義（P<0.01）（圖3）。

3 討論

急性肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征是臨床常見急危重癥，病死率極高[9]。目前對于針對內毒素性肺損傷的治療，不難發現抑制炎癥啟動階段的促炎介質釋放是主旋律[10]。越來越多的研究資料表明炎癥是一個從啟動到消退的程序化過程，炎癥反應的及時消退是防止炎癥走向慢性的關鍵環節，因此，這種內源性炎癥消退機制并在此基礎上提出的“促炎癥消退”的炎癥治療新策略已成為新的研究熱點[10]。

成纖維細胞是人體數量最多的一種間質細胞[2]。成纖維細胞主要功能包括細胞外基質的合成與重造、調節上皮細胞的分化、調節炎癥過程以及參與組織損傷的修復[11]。目前越來越多的證據表明成纖維細胞在炎癥的發生中起到重要的作用，而且能促進炎癥成功消退。通過調控成纖維細胞可以調控炎癥的發生及消退過程。

在呼吸系統炎癥中前列腺素類物質如前列腺素E₂（PGE₂）作為主要的炎癥介質，起到關鍵作用[12]。前列腺素類物質屬于類花生酸家族，是花生四烯酸經過環加氧酶催化而產生[11]。環氧合酶（COX）是花生四烯酸轉化成類花生酸類物質途徑中重要的限速酶[13]。機體中主要有兩種環加氧酶異構體：環加氧酶-1（COX-1）及環加氧酶-2（COX-2）[13]。COX-1屬于管家酶，在大多數組織和細胞中均有表達，其表達基本上是相對恒定的[14]。COX- 2在多數情況下處于靜息狀態或低表達，只有在炎癥反應或其他病理條件下才大量表達[15]。

有研究報道預先給予脂氧素類似物能減輕內毒素所致的小鼠急性肺損傷程度[16]。據報道脂氧素抑制肺纖維化并促進其炎癥消退[17]。另外據Medeiros等[18]報道脂氧素A4同樣能抑制內毒素所致大鼠眼葡萄膜炎的環氧合酶表達及其活性。本研究結果也發現肺成纖維細胞在LPS刺激下COX-2表達增加。據文獻報道COX-2基因敲除的小鼠炎癥反應性增加[19]。另外，環加氧酶是催化花生四烯酸轉化為前列腺素類物質 （PGS） 的限速酶[13]，因此環加氧酶-2表達增加在呼吸系統炎癥發展過程中起到關鍵的作用。

脂氧素是花生四烯酸脂加氧酶代謝產物，主要在炎癥等病理過程中通過跨細胞途徑來合成[5-6]，在炎癥反應中發揮廣泛的抗炎促消退作用。在對肺部疾?。ㄈ缦w外及體內研究都表明脂氧素具有抗炎促炎癥消退作用[20]。據報道脂氧素能抑制肺成纖維細胞的增殖，并抑制肺纖維化[20-21]。筆者利用內毒素（LPS）刺激體外培養的肺成纖維細胞，利用細胞增殖測定，發現1 μg/mL LPS刺激6 h可以建立較為合理的體外炎癥模型。另外脂氧素能抑制LPS刺激下其COX-2蛋白的表達，也同時能抑制LPS刺激下其上清液PGE₂水平。因此，筆者認為脂氧素可能部分通過依賴COX-2的方式促進肺部炎癥消退，從而為急性肺損傷的治療提供了一個新的治療靶點。

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