內質網應激與血管內皮細胞功能障礙關系的研究進展

何夢鈺　左祥榮　解衛平

[摘要] 內質網是調控細胞蛋白質合成、鈣穩態和細胞凋亡的重要細胞器，內皮細胞具有高度發達的內質網，越來越多的研究發現內質網應激參與內皮細胞功能障礙。多種病理狀態如高同型半胱氨酸血癥、高血流剪切應力、高脂血癥、高血糖等都可引起內皮細胞發生內質網應激，適當的內質網應激通過激活未折疊蛋白反應恢復內質網穩態，而內皮細胞內質網功能的長期損傷將導致慢性內質網應激和未折疊蛋白反應，進而增加內皮細胞氧化應激和炎性反應，最終致死亡。由于內皮細胞在維持血管穩態中作用關鍵，其收縮舒張功能障礙，且內皮細胞分泌的血管活性物質失衡，是多種血管性疾病發病的重要環節，尤其在體循環高血壓和肺高血壓病理生理過程中起著關鍵作用。

[關鍵詞] 內質網應激；未折疊蛋白反應；內皮細胞功能障礙；肺動脈高壓

[中圖分類號] R544.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（c）-0030-05

[Abstract] Endoplasmic reticulum is an important organellein regulating protein synthesis， calcium homeostasis and apoptosis. It is known that endothelial cells have highly developed endoplasmic reticulum. Recently， a growing number of studies have found endoplasmic reticulum stress involved in endothelial dysfunction. A various pathological conditions including homocysteinemia， high blood flow shear stress， hyperlipidemia， high glucose can lead to endothelial dysfunction in part through theactivation of ER stress. Proper endoplasmic reticulum stress helps maintain the balance of endoplasmic reticulum by activating unfolded protein response， whilechronic activation of ER stress and UPR pathways inendothelial cells causes a rise of oxidative stress andinflammatory responses， eventually lendingto cell death. Endothelialcells play a crucial role in maintaining vascular homeostasis. It is theloss of normal systolic and diastolic function and the imbalance of endothelial-cell- secreted vasoactive substances that result in a variety of vascular diseases， especially systemic hypertension and pulmonary arterial hypertension.

[Key words] Endoplasmic reticulum stress； Unfolded protein response； Endothelialdysfunction； Pulmonary arterial hypertension

內質網（endoplasmic reticulum，ER）在許多細胞生命過程中起重要生理調控作用。越來越多的證據表明，ER功能障礙誘發的信號網絡既能使細胞自適應，也可促細胞凋亡。病理條件下，ER穩態遭破壞，緩慢激活未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），長期的ER應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）參與許多疾病發生，包括神經退行性變，動脈粥樣硬化，2型糖尿病，肝臟疾病和癌癥[1-2]。正常內皮細胞在維護血管的通透性，調節組織與血液的物質交換，調節血管張力，調控炎性免疫反應，維持血流通暢等方面發揮重要作用。研究表明，內皮細胞功能障礙是多種心血管疾病發病的始動或促進因素[3]。近期多項研究強調ER穩態在維持內皮細胞功能中發揮重要作用。盡管急性ERS反應中UPR起到保護作用，但是病理性慢性ERS可導致內皮細胞損傷，隨后發生炎性反應和細胞凋亡，導致內皮功能障礙，發生相關疾病。本文關注內質網應激和UPR與內皮細胞功能障礙發生的相關機制及其與血管性疾病尤其是是體循環高血壓和肺高血壓發病的聯系。

1 內皮細胞功能障礙

血管內皮細胞不僅構成血管壁和管腔循環血液中成分之間的物理屏障，同時也維持血管穩態，促進物質轉運及白細胞的跨壁轉運。內皮細胞分泌大量維持血管正常功能所必需的調控因子，包括調節血管張力和血液凝固性，調控免疫反應，控制血管細胞生長的細胞因子。生理條件下，內皮細胞分泌一氧化氮（nitric oxide，NO），前列環素（prostaglandins，PGI），血栓調節蛋白，能抑制血小板聚集、平滑肌細胞增殖和白細胞黏附分子的表達，調節血管收縮與舒張。內皮細胞功能障礙是指內皮細胞在病理狀態下（如高血脂、氧自由基、吸煙、高血流切應力等）出現血管活性物質合成釋放間的失衡，如NO分泌減少及活性降低、PGI分泌減少、內皮素（endothelin，ET）分泌增多、內皮依賴性血管相關活性因子異常、內皮結構受損及凝血異常。內皮細胞功能障礙發生原因部分是由內皮細胞NO合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性降低，抗凝物質減少，黏附分子表達增加，趨化因子和細胞因子釋放及活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生增加引起。多種刺激如高血糖、胰島素抵抗、高脂血癥、血流紊亂和氧化應激都可導致內皮細胞發生ER應激。因此，內皮細胞損傷導致內皮細胞功能障礙是一系列病理過程發生的始動環節，與體循環高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、慢性心力衰竭、外周動脈疾病、系統性硬化癥（硬皮?。?、糖尿病和肺動脈高壓等多種疾病的發生發展有密切關系[4]。

2 內質網應激與未折疊蛋白反應

ER對維持細胞功能有重要作用，包括蛋白質折疊，脂質生物合成，鈣平衡和氧化還原反應的動態平衡。生理條件下，ER蛋白質載量和其折疊能力相平衡。當未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網腔聚集，就會引起“未折疊蛋白反應”。由于蛋白質合成增加，錯誤折疊蛋白積累，ER鈣離子及氧化還原反應的失衡，破壞ER穩態，稱為ERS。細胞內UPR反應是一種細胞保護性機制，旨在恢復ER的平衡狀態，維持細胞的正常功能。急性ERS有助于細胞存活，持久嚴重的ERS則導致細胞死亡[5-6]。

UPR信號感受器主要是三種跨膜蛋白受體：抑肽酶內質網激酶樣激（pancreatic ER kinase RNA-like ER kinase，PERK），激活轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）和肌醇依賴酶1（inositolrequiring enzyme 1，IRE1）。在生理狀態下，這三種ERS感受器通過與內質網分子伴侶的免疫球蛋白重鏈（BiP）/GRP78（glucose regulated protein 78）結合而處于靜息狀態，一旦未折疊蛋白聚集，BiP便與這三個感受器解離，激活并觸發UPR。PERK通過自身磷酸化和寡聚化激活，進而磷酸化真核翻譯起始因子2α（elongation initiation factor 2α，eIF2α），導致除活化轉錄因子4（activatingtranscriptionalfactor4，ATF4）外整個細胞內翻譯過程衰減。ATF4是參與恢復ER穩態的基因；然而，在慢性ERS情況下，PERK-ATF4通路誘導促凋亡介質CHOP（C/EBP homologous protein，也稱為GAD D153）及其下游靶基因——DNA損傷誘導蛋白-34（DNA damageinducibleprotein-34，GADD34）表達。IRE1α是IRE1廣泛表達的異構體，有激酶/核糖核酸酶雙重功能，通過自身磷酸化和寡聚化激活，可剪切mRNA編碼的X-box結合蛋白-1（x-box binding protein 1，XBP1）。XBP1的剪接異構體有轉錄因子的功能，誘導很多UPR反應必需基因的表達，從而提高ER折疊能力并擴展ER膜表面積。在慢性ERS過程中，IRE1通路持續激活，不但可以經過TRAF2（ tumor necrosis factor receptor-associated receptor 2）-ASK1（ apoptosis signal-regulating kinase 1）-JNK（ c-Jun N- terminal kinase）途徑來激活JNK，誘導細胞凋亡；還可以直接或間接激活含caspase-12，進而激活caspase-9和caspase-3，誘導細胞凋亡。XBP1也協同ATF4-CHOP通路誘導細胞凋亡[5]。ERS過程中，ATF6轉位至高爾基體，經S1P和S2P蛋白酶裂解，隨后易位到細胞核并激活ERS相關基因。ATF6與XBP1也參與活化ER相關蛋白系統（ER associated degradation，ERAD）的降解過程，ERAD通過泛素-蛋白酶體途徑消除錯誤折疊蛋白質[7]。

3 ERS參與多種病理狀態下的內皮細胞功能障礙

缺血、缺氧、炎癥、氧化應激等是導致ERS的主要因素，大量研究證實ERS參與了這些因素導致的內皮細胞功能障礙[8]。此外，ERS也參與了高同型半胱氨酸血癥、高血流剪切應力、高脂血癥、高血糖等因素導致的內皮細胞功能障礙。

3.1 高同型半胱氨酸血癥

血漿中同型半胱氨酸升高是心血管系統疾病的一個獨立危險因素。已證實同型半胱氨酸是ERS的誘導劑。雖然同型半胱氨酸誘導內皮細胞功能障礙的機制還未完全闡明，但IRE1/TRAF2途徑和CHOP的上調激活JNK和ATF3可引起血管內皮細胞死亡；eIF2α誘導T細胞相關基因51（T-cell death-associated gene 51，TDAG51）介導的細胞間黏附功能的損傷也是誘發內皮細胞凋亡的途徑。

3.2 血流剪切應力

Davies等[9]近期總結了血流紊亂和ERS/UPR通路激活間的關系，發現動脈粥樣硬化高血流剪切應力區域的一個特征是發生慢性ERS和UPR通路的激活，且該區域易發生慢性炎性反應。分析UPR相關蛋白質表達提示盡管IRE1α和ATF6途徑增加，但是PERK-ATF4分支途徑并未被激活。因此，推測UPR對血流動力學紊亂有保護作用。

3.3 高脂血癥

氧化的低密度脂蛋白（oxidized low density lipoproteins，OxLDL）可誘導內皮細胞凋亡，在動脈粥樣硬化發展早期起重要作用。最近研究發現在嚴重動脈粥樣硬化且脂質富集的病變區域有磷酸化的IRE1α，證實ERS/UPR途徑可通過激活IRE1α-JNK通路促動脈粥樣硬化發生。Gora等[10]用磷酸化的LDL處理人臍靜脈內皮細胞發現UPR的三個信號途徑以及白介素-6（IL-6）和IL-8均被激活。高脂血癥患者產生的富含三酰甘油的脂蛋白（triglyceride-rich lipoproteins，TGRL）顆粒能增加人主動脈內皮細胞中血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）的表達，而健康人產生的TGRL顆?？山档蚔CAM-1表達[11]。另有實驗證明TGRL激活IRE1α-XBP1和PERK-eIF2α-CHOP通路促進粥樣硬化發生。小干擾RNA抑制CHOP通路能夠減少TNFα誘導的VCAM-1表達。此外，Dickhout等[12]用Sin-1處理人血管內皮細胞，模擬動脈粥樣硬化病理狀態，發現血管內皮細胞中GRP78/GRP94和TDAG51蛋白表達增加，同時eIF2α發生磷酸化，說明ERS參與了動脈粥樣硬化的發生過程。

3.4 高血糖

高血糖可誘導內皮細胞發生氧化應激反應和ERS，導致ROS產生過多及后續的病理過程。Chen等[13]在鏈脲菌素（streptozotocin，STZ）誘導1型糖尿病模型中證實，炎性反應和血管滲漏發生的主要原因是ATF4介導的STAT3激活，而降低ATF4水平可抑制炎性反應和血管滲漏。另有細胞實驗表明抑制STAT3可緩解高血糖促發的ERS，提示ERS和炎癥通路間有相互調節作用。作者證明在STZ糖尿病模型中表皮生長因子受體酪氨酸激酶（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase，EGFR）的活化誘發ERS、微血管功能障礙和心肌纖維化，導致心血管并發癥。EGFR磷酸化增加導致PERK-eIF2α-ATF4分支途徑激活，但并不活化ATF6。藥物抑制EGFR激酶活性可舒張腸系膜動脈，下調NADPH氧化酶2、NADPH氧化酶4表達，提示EGFR是調控內皮細胞發生ERS上游的新位點[14]。

2型糖尿病是慢性炎癥性疾病，ERS也參與2型糖尿病的病理過程。血糖升高及伴隨的胰島素抵抗使內皮細胞發生ERS，活化炎癥信號通路，最終導致2型糖尿病相關的代謝障礙。ERS通過活化XBP1及ATF4，增加IL-8，IL-6及單核細胞趨化因子產生從而調控炎癥相關基因的表達[15]。

研究發現當內皮細胞處于高糖環境時，CHOP介導的ERS活化胞內的NADPH氧化酶2，而NADPH氧化酶2、NADPH氧化酶4的活化促進ROS二聚體的形成，進而使NO轉變為ONOO-，且高糖環境激活ASK1，減少eNOS產生，導致內皮細胞功能障礙和凋亡[16-17]。

4 內質網應激介導的內皮細胞功能障礙在高血壓疾病中的作用

4.1 體循環高血壓

高血壓時血流動力學的改變，缺血、缺氧和高壓的發生以及血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）、ET-1等生物活性因子增加都可激活血管內皮細胞ERS凋亡相關途徑，導致細胞損傷和凋亡。Young等[18]第一次揭示了ERS在Ang-Ⅱ誘導的高血壓模型中的作用。他們的研究專注于腦內ERS證明Ang-Ⅱ上調ERS的標志物，包括BiP/GRP78，PERK，CHOP。使用化學伴侶?；切苋パ跄懰幔╰auroursodeoxycholic，TUDCA）治療或局部補充ER分子伴侶Bip/GRP78可改善ERS并抑制Ang-Ⅱ誘導的高血壓。此外，ERS抑制劑TUDCA或4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）通過降低生長轉化因子α（TGFα）活性、增加eNOS磷酸化減少心肌纖維化，改善大血管內皮細胞功能。TUDCA或4-PBA抑制ERS對自發性高血壓大鼠有明顯降低血壓的作用[19]，ERS通過增強ERK1/2和磷脂酶A2的磷酸化促進環氧酶-1的表達和PGI產生。抑制ERS可減少血管活性物質前列腺素物質產生從而改善血管內皮依賴性的收縮反應[19]。

4.2 肺高血壓

肺高血壓（pulmonary hypertension，PH）是一大類由多種病因引起，以肺血管床結構和（或）功能改變，導致肺循環壓力升高直至出現右心衰竭和死亡為特征的臨床綜合征，包括肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）、肺靜脈高壓（pulmonary venous hypertension，PVH）和混合性肺高壓三種[20]。越來越多的證據表明失調的ROS和NO信號通路與PAH發病相關聯。氧化應激反應在PH病理過程中起核心作用，針對磷酸二酯酶5抑制劑，前列腺素類似物，ET受體阻斷劑是PAH的常規療法[21]。然而，ERS和UPR在PH中的致病作用近期才被關注[22]。系統性硬化相關PAH（systemic sclerosis-associated PAH，SSc-PAH）患者的肺血管內皮細胞和肺巨噬細胞中發現ERS標志物Bip和CHOP水平顯著升高[23]。

在SSc-PAH，GATA6-KO小鼠模型中觀察到ERS標志物表達增加。野生型小鼠在缺氧處理1個月后Bip和CHOP增加，而GATA6-KO小鼠缺氧處理一個月后肺動脈壓力升高更顯著，同時伴有廣泛的肺血管重構和右心室肥大，且肺組織內皮細胞和巨噬細胞中BiP和CHOP表達上調，表明在缺氧狀態下ERS和UPR主要發生在巨噬細胞和血管內皮細胞中[24]。ET-1是一種有效的血管收縮劑和促內皮細胞分裂劑，也受ERS途徑的調節，是導致肺血管阻力增加和PH發生的重要致病因素。Lenna等[25]發現毒胡蘿卜素通過增加ATF4/c-Jun轉錄復合物的形成上調內皮細胞中ET-1的表達。同時，在觀察人類白細胞抗原-B35（HLA-B35）對內皮細胞的生物學效應中發現，GRP78/Bip、CHOP 可影響 ET-1的生成，參與內皮細胞功能障礙發生。Toll樣受體3配體通過ATF4/c-Jun復合物介導ET-1的上調。對大鼠主動脈內皮細胞的研究發現，內皮細胞特有的依賴于ERS的ET-1表達上調，然而，ERS對ET-1的影響還有待進一步研究。

范小芳等[26]采用常壓低氧法構建慢性低氧高二氧化碳性PAH大鼠模型，發現肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞凋亡明顯增加，并且肺組織GRP78、GRP94、caspase-12 mRNA表達明顯增加，免疫組化發現肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞GRP78、GRP94蛋白表達明顯升高。因此，該研究認為ERS介導的肺血管內皮細胞凋亡與大鼠慢性低氧性PAH、肺血管重構的病理過程有關。

5 小結

內皮細胞作在維持血管穩態中起重要作用，其功能缺陷與多種心血管疾病的發生密切相關。目前，越來越多的研究關注ERS可能介導內皮細胞功能障礙，參與糖尿病、高脂血癥、高血壓和PH等多種疾病的病理過程，4-PBA和?；切苋パ跄懰醿煞N化學伴侶可以抑制過度的ERS，改善內皮細胞功能障礙，并且在小的臨床研究中顯示出改善肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病[27]。相信，隨著對ERS介導內皮細胞功能障礙機制研究的更加深入，會發現更有效而特異的ERS抑制劑，為預防和治療高血壓和PH等血管性疾病開辟新領域。

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（收稿日期：2015-06-08 本文編輯：蘇 暢）