諾沃霉素植生鏈霉菌發酵培養基的優化

丁璟劍等

摘要：通過優化發酵培養基中的成分及其含量，提高諾沃霉素有效組分的產量。以高效液相色譜檢測目標產物的峰面積作為指標，通過單因素試驗獲得最佳碳源及氮源。使用正交試驗等獲得最佳發酵培養基：葡萄糖4.0%，酵母浸粉0.5%，豆粕1.0%，磷酸氫二鉀0.035%，碳酸鈣0.05%，豆油0.1%。相關發酵條件為pH 7.0，種齡96 h，接種量10%，發酵溫度28 ℃，發酵時間120 h。根據高效液相色譜檢測結果，在最佳發酵條件下，目標產物產量比對照培養基提高了657%。

關鍵詞：培養基優化；正交試驗；諾沃霉素；發酵條件

中圖分類號：Q939.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-3928-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.024

Optimization of Fermentation Media with Novonestmycin Streptomyces phytohabitans

DING Jing-jian， WAN Zhong-yi， FANG Wei， PENG Dong-lin

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center/The Branch Center of Biopesticide， Hubei Agricultural Sciences and Technology Innovation Center， Wuhan 430064， China ）

Abstract： In order to increase the production of Novonestmycin produced by Streptomyces phytohabitans HBERC-20821，the composition and content of the fermentation media were optimized using single-factor test and orthogonal design. According to the result of HPLC， the optimum parameters were obtained as follows： 4.0% glucose， 0.5% yeast extract， 1.0% soybean meal， 0.035% K2HPO4，0.05% CaCO3， 0.1% soybean oil. pH 7.0，seed age 96 h， inoculum volume 10%， fermentation temperature 28 ℃， fermentation time 120 h. Under the optimized conditions，the product output of Novonestmycin increased by 657% compared with the contrast medium.

Key words： media optimization； orthogonal design； Novonestmycin； fermentation conditions

隨著化學農藥的長期大量使用，各種問題逐漸暴露出來，如利用率低、難降解、污染范圍廣、選擇性不高、害蟲產生抗藥性、危害人類健康等。因此，生物農藥逐漸受到人們的重視[1]。相對于化學農藥而言，生物農藥具有選擇性高、環境相容性好、對天敵較安全、不容易產生抗性、生產工藝比較簡單等優點[2]。

根據來源，生物農藥可分為植物源、微生物源等，農用抗生素是源于微生物的一類具有明確化學結構、明確活性的天然產物[3]。在中國農用抗生素屬于生物化學農藥，它具有生物農藥環境相容性好的優點，也有化學農藥活性明確、使用效果好的優點，因而是現在和將來最受歡迎的生物農藥種類。

諾沃霉素（Novonestmycin）是湖北省生物農藥工程研究中心在世界上首次發現的一種新的32元大環內酯類抗生素[4]，具有廣譜抗真菌活性。該抗生素對很多植物病原真菌如黃瓜棒孢菌、芒果褐斑病菌、立枯絲核菌等具有很強的活性，活性強度（最低抑菌濃度MIC）超過多烯類抗生素、放線菌酮，具有良好的應用開發前景。提高產生菌發酵水平，對于其工業化生產是十分重要的。試驗著重研究其搖瓶培養基的優化。

培養基是用來供抗生素產生菌生長、繁殖、代謝合成抗生素的，是按一定比例組成的營養物質。培養基的成分和配比合適與否，對產生菌的生長、發育、次級代謝產物的合成有很大的影響，同時還會影響到提取工藝、產品質量及成本[5]。因此根據菌種特點探索出最適合其生長、并有較高目標產物產量的培養基是發酵技術最重要的一環，同時也為將來的工業化生產做準備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 植生鏈霉菌（Streptomyces phytohabitans）HBERC-20821，由湖北省生物農藥工程研究中心分離保存。

1.1.2 培養基 斜面培養基：ISP-2培養基。采用18 mm×180 mm玻璃試管，每管裝瓊脂培養基8～10 mL。

種子培養基（g/L）：甘露醇20；大豆蛋白胨10；磷酸氫二鉀0.35；碳酸鈣0.5；豆油1； pH 7.0。采用500 mL帶檔板三角瓶，每瓶裝培養基100 mL，121 ℃滅菌30 min。

對照發酵培養基（g/L）：同種子培養基。

1.1.3 試驗儀器 大振幅搖床SPH-3222（上海世平實驗設備有限公司）；高速離心機GL21M（長沙湘智離心機儀器有限公司）；Waters 2695高效液相色譜儀（Waters 2996二極管陣列式檢測器）；自動發酵罐BIOTECH-20-200JS（上海保興生物設備工程有限公司）；天平JY6002電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；旋轉蒸發儀RE-2000（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的搖瓶發酵 在無菌條件下，從斜面取8～10 mm的菌餅轉移至種子搖瓶中，在28 ℃，150 r/min旋轉式搖床上，振蕩培養96 h，然后按10%（V/V）的接種量轉接至發酵培養基中，將培養基置于28 ℃、150 r/min大振幅搖床上，振蕩培養120～144 h，即完成發酵。

1.2.2 發酵液鏡檢及提取 取少量發酵液測量pH并進行鏡檢，再向搖瓶中加入100 mL乙酸乙酯后，于180 r/min大振幅搖床上振蕩萃取1 h，離心分離出酯相，旋蒸，除去溶劑，再以1 mL甲醇溶解后，進行HPLC分析。

1.2.3 產物的高效液相色譜（HPLC）分析 采用Sunfire C18色譜柱，150 mm×2.1 mm（i.d），粒徑3.5 μm，柱溫40 ℃，進樣量為2 μL，流動相為去離子水和色譜純乙腈，梯度洗脫，檢測波長為260 nm[6]。

1.2.4 HPLC分析結果的處理 根據HPLC紫外吸收光譜結果，可由出峰時間確定產物組分，由峰面積確定對應組分產量[7]。

1.2.5 搖瓶發酵培養基優化[8] 碳源單因素試驗：只改變原培養基中碳源，其他組分、培養條件保持不變，按照“1.2.1”方法進行搖瓶試驗。

氮源單因素試驗：只改變原培養基中氮源，使用最佳碳源，其他組分、培養條件保持不變，按照“1.2.1”方法進行搖瓶試驗。

碳氮源最佳比例的探索：在獲得最佳碳源和氮源的基礎上，進行多組試驗摸索碳氮用量的最佳比例。改變碳源及氮源的用量，其他組分不變、培養條件保持不變，按“1.2.1”方法進行搖瓶試驗，大致確定最佳配比。

培養基的進一步改良：在獲得一些優化培養基的主要參數后，同時考慮降低生產成本等方面的問題，對培養基配方進一步改良。使用正交試驗法[9，10]，最終確定HBERC-20821的最佳發酵培養基配方。

2 結果與分析

2.1 碳源優化

進行碳源單因素試驗，改變原搖瓶培養基中碳源成分，其他組分、培養條件保持不變，培養方法按照“1.2.1”，檢測方法按照“1.2.3”。試驗結果如表1、圖1所示。

由不同碳源的HPLC檢測結果可以看出，HBERC-20821對葡萄糖和糖蜜的吸收和利用要優于其他碳源。HBERC-20821對于蔗糖和甘油利用效果不佳。鏡檢結果也與HPLC檢測結果相符。根據產物產量對幾種碳源進行排序，依次為糖蜜、葡萄糖、甘露醇、甘露醇*、飴糖、可溶性淀粉。綜合考慮培養基成本和配制培養基的方便程度考慮，確定葡萄糖為最佳碳源。

2.2 氮源優化

改變搖瓶培養基中氮源成分，使用葡萄糖作為氮源，其他組分、培養條件保持不變，培養方法按照“1.2.1”，檢測方法按照“1.2.3”。試驗結果如表2、圖2所示。

由不同氮源的HPLC檢測結果可以看出，HBERC-20821對酵母浸粉的吸收和利用要明顯好于其他氮源。根據諾沃霉素產量，將幾種氮源進行排序，由多到少依次為酵母浸粉、玉米漿、黃豆粕、豆餅、大豆蛋白胨、棉子粉、玉米粉、硫酸銨。HBERC-20821對于不溶性和無機氮源的利用效果不佳。由以上試驗結果確定酵母浸粉為最佳氮源。

2.3 碳氮源最佳比例的探索

在進行碳源、氮源單因素試驗確定最佳碳氮源后。進行多組試驗摸索碳氮用量的最佳比例，試驗培養基配方見表3。

只改變原搖瓶培養基中碳源與氮源的用量，其他組分、培養條件保持不變，培養方法按照“1.2.1”，檢測方法按照“1.2.3”。試驗結果如表4、圖3所示。

根據HPLC檢測結果，組別4和6中產物產量極低，推測培養基中碳源含量高于4%，氮源含量高于2%時菌株代謝將會明顯受到影響。最適宜HBERC-20821生長的為組別5中的配方，相對于對照組中諾沃霉素產量提高了45.7%，即最適碳氮源比為4∶1。在搖瓶水平上，獲得HBERC-20821最高產量的配方為：葡萄糖4.0%，酵母浸粉1.0%，磷酸氫二鉀0.035%，碳酸鈣0.05%，豆油0.1%。

2.4 碳氮源正交試驗

通過上面的試驗已經獲得了HBERC-20821生長的最佳碳源、氮源及其比例，但由于酵母浸粉作為氮源成本相對較高，從降低生產成本考慮，在保證較高產量的條件下使用更為廉價的豆粕代替部分酵母浸粉作為該菌生長所需的氮源。使用正交試驗法進一步改良培養基，試驗因素水平設置見表5，試驗結果見表6。

按照因素水平設置表，改變原搖瓶培養基中碳源與氮源的用量，其他組分、培養條件保持不變，培養方法按照“1.2.1”，檢測方法按照“1.2.3”。

L9（33）試驗結果見表6，由表6可知，影響程度由R值可知：B>A>C，即在葡萄糖、酵母浸粉、豆粕三種影響因素中，酵母浸粉影響因素最大。由表6可知，諾沃霉素A+B峰面積最大值為編號8，即產量最高的組合為A3B2C1。

綜合以上結果，可以得出HBERC-20821最佳發酵配方為：葡萄糖4.0%，酵母浸粉0.5%，豆粕1.0%，磷酸氫二鉀0.035%，碳酸鈣0.05%，豆油0.1%。改良過的培養基相對于原配方培養基，諾沃霉素產量提高了657%。

3 小結與討論

通過碳氮源單因素試驗獲得植生鏈霉菌HBERC-20821最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母浸粉。通過多組試驗確定碳氮源的最佳比例約為4∶1。根據前面試驗獲得的相關參數，優化后的發酵培養基配方為：葡萄糖4.0%，酵母浸粉0.5%，豆粕1.0%，磷酸氫二鉀0.035%，碳酸鈣0.05%，豆油0.1%。根據HPLC檢測結果，在最佳發酵條件下，諾沃霉素產量比對照培養基提高了657%。

本試驗僅對諾沃霉素搖瓶發酵培養基的配方進行優化，其他發酵參數如pH、接種量、發酵溫度、攪拌、發酵時間等也會對發酵產生重要影響。下一步的發酵工作，將在小型自動發酵罐上進行，以優化發酵工藝，并進行中試放大，將諾沃霉素向產業化方向推進。

參考文獻：

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