鴨胚腎細胞用于鴨肝炎弱毒增殖的研究

盧順等

摘要：為分析鴨胚腎細胞用于鴨肝炎病毒增殖的可能性，從鴨胚腎細胞的制備、體外培養、鴨肝炎弱毒在鴨胚腎細胞中的增殖等方面入手，初步分析了鴨胚腎細胞體外培養和用于鴨肝炎病毒增殖的可行性。結果表明，鴨胚腎細胞能夠體外培養并形成良好的細胞單層，形態多為多邊形或梭形；原代鴨胚腎細胞可以用于增殖鴨肝炎弱毒A66株，毒價（ELD50）達10-4.2/0.2 mL。說明鴨胚腎細胞適合用于鴨肝炎病毒的增殖，有望用于鴨肝炎病毒疫苗的生產。

關鍵詞：鴨胚腎細胞；體外培養；鴨肝炎弱毒

中圖分類號：S852.65；S858.32 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-3983-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.038

Proliferation of Attenuated Duck Hepatitis Virus in Duck Embryo Kidney Cells

LU Shun， GAO Qi-shuang，LIU Wu，CHEN Zhi-hua，ZHOU Li，ZHAN Cai-yao，TONG WEI-wen，

TAO Bi-fei，XIA Yu，WANG Lian-fang，HUA Juan

（Wuhan Institute of Animal and Veterinary Science， Wuhan 430208， China）

Abstruct：In this study the possibility of proliferation of duck hepatitis virus in duck embryo kidney cell were analyzed through the preparation of duck embryo kidney cell， cultured in vitro and the proliferation of duck hepatitis virus in the cell. The results showed that duck embryo kidney cell could be cultured in vitro； most of the cells were polygonal or fusiform. Duck embryo kidney cell could be used in proliferation of attenuated duck hepatitis virus A66， and the virus titer could reach 10-4.2/0.2 ml （ELD50）. It indicated that duck embryo kidney cell was suitable for duck hepatitis virus proliferation and might be used to produce vaccines.

Key words：duck embryo kidney cell； in vitro cultivation； attenuated duck hepatitis virus

近年來，鴨病毒性肝炎在中國水禽養殖區廣泛流行，給養鴨業帶來了巨大的威脅。鴨病毒性肝炎由鴨肝炎病毒（DHV）引起，主要危害3周齡以內的雛鴨，病死率可達100%[1]。已報道的鴨肝炎病毒有3個血清型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。中國已發現Ⅰ型和Ⅲ型鴨肝炎病毒，其中流行的主要是Ⅰ型[2]。目前尚無治療鴨病毒性肝炎的特效藥物，接種鴨肝炎疫苗是預防和控制該病的最經濟且行之有效的方法。

在國內，鴨肝炎疫苗的生產還主要依靠傳統的雞胚培養技術[3]，使用細胞生產鴨肝炎病毒疫苗尚處在研究階段，暫時還沒有細胞源的鴨肝炎病毒疫苗上市銷售。相比雞胚培養技術，細胞培養病毒具有周期短、質量易控制和抗原純度高等優點[4]，因此使用細胞生產鴨肝炎病毒疫苗是未來的發展方向。這也使得尋找適合培養鴨肝炎病毒的細胞成為研究的熱點。目前，已報道用于培養鴨肝炎病毒的細胞系主要是雞胚或鴨胚成纖維細胞系，關于其他細胞的研究較少。因此，尋找新的適合于鴨肝炎病毒增殖的細胞，能為鴨肝炎病毒及其疫苗的研究工作提供新的細胞材料。本研究旨在探索鴨胚腎細胞用于鴨肝炎病毒增殖的可能性，為鴨肝炎病毒的研究和疫苗生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養基及主要試劑

DMEM高糖培養基（粉劑）和胎牛血清購自GIBCO公司；雙抗（青霉素、鏈霉素混合液，100×）、胰蛋白酶購自Sigma公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 毒株、鴨胚和雞胚

鴨肝炎病毒弱毒A66株（疫苗毒株）購自南京天邦生物科技有限公司；12日齡鴨胚（江漢鴨）購自武漢市春江禽業有限責任公司；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制 細胞培養基配制：DMEM培養基按說明書配制，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存備用。臨用前加入15%胎牛血清和1%雙抗配制成工作液。細胞消化液配制：取胰蛋白酶粉劑，用PBS配制成0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA的細胞消化液，0.22 μm過濾除菌，分裝于10 mL小瓶，-20 ℃凍存備用。

1.3.2 鴨胚腎細胞的制備 取12日齡的鴨胚，在無菌環境中打開氣室取出胚胎，立即放入盛有無菌PBS（含2%的雙抗）的平皿中，漂洗數次。將胚胎放入新的平皿中，剪開腹部，取出腎，置于另一無菌平皿中，PBS漂洗2次。用眼科剪將腎組織剪成糜狀，加入2 mL 細胞消化液于37 ℃消化15 min。加入細胞培養基終止消化反應，離心收集細胞。細胞用培養基重懸，反復吹打制備成細胞懸液，分裝于100 mL規格的細胞瓶中，于37 ℃、5% CO2的培養箱中進行原代培養。

1.3.3 鴨胚腎細胞的傳代培養 3 d后原代細胞貼滿細胞瓶底，棄去培養上清液，更換新的培養液。再次培養3 d后，用細胞消化液消化細胞。將消化好的細胞用培養基重懸，輕輕吹打使之分散。重懸的細胞在原細胞瓶中靜置培養。細胞長滿瓶底后，再次用消化液消化細胞，按1∶2的比例（1瓶內的細胞分裝到2個細胞瓶內）進行傳代培養。之后每當細胞長滿單層，即進行傳代。

1.3.4 鴨肝炎弱毒在鴨胚腎細胞中的增殖 待鴨胚腎細胞長成單層，棄去培養液，用PBS清洗細胞1次，接種2 mL鴨肝炎病毒液（200 ELD50/mL），置培養箱37 ℃吸附1 h，棄去多余的病毒液，加入37 ℃ 預溫的細胞維持液（含1%胎牛血清的DMEM），置37 ℃含5% CO2的培養箱中繼續培養，逐日鏡檢，觀察細胞變化。收獲每次接毒的細胞培養物，反復凍融3次，離心收集上清液，棄去沉淀。按照常規方法進行連續傳代，觀察細胞接毒后是否發生病變。

1.3.5 鴨肝炎病毒毒價的測定 取接毒的細胞培養物，用Hank′s液10倍倍比稀釋，每個稀釋度經尿囊腔接種雞胚4枚，0.2 mL/枚，記錄雞胚死亡情況，按Reed-Muench方法[5]計算雞胚半數致死量（ELD50 ）。

1.3.6 病毒在鴨胚腎細胞上的生長曲線 收集接毒后12、24、36、48、60、72 h的細胞培養物，凍融3次后，按上述方法接種SPF雞胚，測定細胞培養物的ELD50，根據病毒滴度繪制生長曲線。

2 結果與分析

2.1 鴨胚腎細胞的生長情況

原代的鴨胚腎細胞靜置培養到第二天時，可看到大部分細胞已貼壁生長，從形態上看主要是多邊形和梭形。對細胞進行換液后繼續培養至第六天，細胞形成單層，排列緊密，具有典型的上皮細胞特征（圖1）。細胞傳至第四代時，大部分細胞逐漸死亡。存活下來的細胞經數次傳代后，生長速度逐漸變快，傳代后3 d即可形成細胞單層。

2.2 DHV在鴨胚腎細胞上致細胞病變情況

將DHV弱毒接種在鴨胚腎細胞單層上，傳至第三代時出現細胞病變，表現為細胞變圓、脫落（圖2）。對照組細胞無明顯病變。

2.3 DHV在鴨胚腎細胞培養物中的毒價

按Reed-Muench法計算收獲的病毒培養物的毒價（ELD50），結果前3代病毒培養物的毒價分別為10-3.6/0.2 mL、10-4.2/0.2 mL和10-4.2/0.2 mL。

2.4 DHV在鴨胚腎細胞中的增殖曲線

鴨胚腎細胞接毒后，收集不同時間的細胞培養物，接種SPF級雞胚測定ELD50。結果顯示接毒36 h后毒價能達到峰值（圖3）。

3 小結與討論

目前，鴨肝炎病毒的培養主要采用SPF雞胚接種，該方法需要耗用大量的優質雞胚。SPF雞胚的來源十分有限，不能隨時獲得，質量也難以控制[6]，使用受到一定限制。此外，利用雞胚生產鴨肝炎病毒疫苗，在處理廢棄的雞胚殘體時只能采用焚燒或其他無害化的處理方法，對環境有一定的污染。相比之下，細胞培養病毒具有周期短、質量易控制、抗原性好和環保等優點。為此，本試驗研究了鴨胚腎細胞用于增殖鴨肝炎病毒的可能性，為開展鴨肝炎病毒的相關基礎研究提供了參考。

本研究制備了鴨胚腎細胞，研究了鴨肝炎病毒在該細胞中的增殖特性。結果表明，鴨肝炎病毒可以適應鴨胚腎細胞，3次傳代后產生明顯的細胞病變，培養物的病毒滴度可達10-4.2/0.2 mL（ELD50）。用鴨胚腎細胞增殖鴨肝炎病毒比使用雞胚或鴨胚增殖病毒更便捷、易行，為開展鴨肝炎病毒分子生物學研究提供了便利。研究中還發現，原代鴨胚腎細胞在體外傳3代后，大部分細胞逐漸死亡，這與許靜等[7]報道的鴨胚成纖維細胞培養相似。少數存活的細胞能逐漸適應傳代培養。如能將這些細胞建立成永生性的細胞系，則能為鴨肝炎病毒等病原的生物學研究及其細胞疫苗的研發提供細胞資源。

國內外的研究表明，Ⅰ型鴨肝炎病毒能在鴨胚成纖維細胞、雞胚成纖維細胞和鴨胚肝細胞上增殖，且部分毒株經傳代適應后能引起細胞病變。吳培福等[8]報道鴨肝炎病毒S株能引起鴨胚肝細胞病變，主要表現為細胞萎縮、變圓和細胞脫落，但不同毒株致細胞病變的能力有差異，這可能與毒株的毒力以及鴨的品種有關。張小飛等[9]報道鴨肝炎病毒A66株能在雞胚成纖維細胞上增殖，且能產生細胞病變。付玉志等[10]報道鴨肝炎病毒野毒株ZJ-08能在鴨胚成纖維細胞中增殖，并導致典型的細胞病變。本試驗中觀察到鴨肝炎病毒在江漢鴨的腎細胞上能引起病變，但第一代病變不明顯。雞胚半數致死試驗表明，鴨肝炎病毒在鴨胚腎細胞上傳代后仍能致死SPF雞胚。本研究證實，鴨肝炎病毒弱毒能在鴨胚腎細胞中增殖，這為鴨肝炎病毒及其細胞源疫苗的研究提供了理論基礎。

參考文獻：

[1] 張艷芳，羅 薇，劉內生，等.鴨肝炎病毒的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2011，38（7）：171-175.

[2] 張大丙.鴨病毒性肝炎研究概況[J].中國家禽，2010，32（22）：39.

[3] 孫慶歌，肖愛芳，朱 薇，等.鴨病毒性肝炎疫苗研究進展[J].中國獸藥雜志，2013，47（11）：54-57.

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[5] 殷 震，劉景華.動物病毒學[M].第二版.北京：科學出版社，1997.

[6] TREE J A，RICHARDSON C，FOOKS A R，et al.Comparison of large-scale mammalian cell culture systems with egg culture for the production of influenza virus A vaccine strains[J].Vaccine，2001，19（25-26）：3444-3450.

[7] 許 靜，李進軍，熊 勝，等.鴨胚成纖維細胞培養、傳代及保存方法的研究[J].中國家禽，2012，34（13）：9-13.

[8] 吳培福，張國中，韓 博，等.應用鴨胚肝細胞擴增鴨肝炎病毒[J].中國獸醫雜志，2009，45（6）：33-35.

[9] 張小飛，解啟發，潘孝成，等.鴨肝炎病毒A66弱毒株在雞胚成纖維細胞上的培養[J].中國獸醫學報，2000，20（1）：19-21.

[10] 付玉志，張洪輝，李傳峰，等.Ⅰ型鴨肝炎病毒在鴨胚成纖維細胞系中的增殖特性研究[J].中國預防獸醫學報，2013，35（2）：110-113.