油污土壤中脂肪酶產生菌的篩選及產酶條件優化

曲威等

摘要：為了獲得脂肪酶產生菌，進而獲得高酶活菌株，試驗采集東營勝利油田被廢油長期污染的土壤，通過羅丹明B平板法進行菌株分離篩選，并采用橄欖油乳化法測定脂肪酶酶活。經16S rRNA鑒定，確定為銅綠假單胞菌屬，命名為Pseudomonas aeruginosa S8。并對該菌株的搖床培養產酶條件進行了初步研究，采用單因素試驗和正交試驗對S8菌株產脂肪酶的條件進行優化，得到最佳發酵培養基與條件為葡萄糖8 g/L，酵母粉8 g/L，硫酸銨6 g/L，花生油 20 g/L，起始pH 7.0，接種量9%，溫度30 ℃，發酵培養時間72 h，為工業化生產提供了出發菌株。

關鍵詞：脂肪酶；銅綠假單胞菌；篩選；鑒定；優化

中圖分類號：TQ925+.6；Q556+.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-4002-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.044

Screening of Lipase-Producing Strain in Oil Field and Optimization

of the Lipase Producing Conditions

QU Wei，SHAO Lei，SONG Li-fen，XU Rong-xue

（Yantai Academy of China Agricultural University，Yantai 264670， Shandong. China）

Abstract：In order to obtain lipase-producing strain of the bacteria，thus obtain high activity strains，the strain was screened from long waste-oil-pollutedsoil near Shenglin oil field in Dongying through Rhodamine B plate method and the lipase activity was determined with olive oil emulsification method. A strain S8 producing lipase was screened， which was identified as Pseudomonas aeruginosa by the identification of 16S rRNA. The fermentation conditions of a lipase from S8 were determined by the single-factor experiment and orthogonal design. The result showed that the optimal medium composition for lipase production was as follows： glucose 8 g/L，yeast extract 8 g/L， （NH4）SO4 6 g/L， peanut oil 20 g/L. The optimal fermentation conditions were pH of 7.0， fermentation temperature of 30 ℃， inoculation amount of 9%， and fermentation time of 72 h， which provided foundation for the further study of lipase production fermentation.

Key words： lipase； pseudomonas aeruginosa； screening； identification； optimization

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）是一類廣泛存在于微生物和動植物細胞中的水解酶，能在油水界面催化甘油三酯生成甘油及脂肪酸[1]，因其在非水相條件下催化反應可逆，可用于催化醇解、酯化和酯交換反應[2]。生物來源的脂肪酶由于反應條件緩和，對環境污染小，成本低，被廣泛應用于食品、制革、飼料、洗滌和油脂水解等工業領域[3，4]，并且在生物柴油的制備、地溝油的回收利用等方面有不可替代的應用價值[5]。

在自然界中，脂肪酶主要存在于動物胰臟、植物種子和微生物中，由于微生物種類多、繁殖快，并且所產生的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，比動物脂肪酶酶解作用的pH和溫度范圍更寬[6]，適合于工業化大生產和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業用脂肪酶的重要來源。

本研究從山東東營勝利油田附近被廢油長期污染的土壤中成功篩選出一株產脂肪酶效果較好的菌株，經過鑒定，確定為銅綠假單胞菌，命名為Pseudomonas aeruginosa S8，并對其產酶的培養條件進行優化，得到該菌產酶的最佳發酵條件，以期為脂肪酶的生產提供優良酶源。

1 材料與方法

1.1 材料

土樣：采自東營勝利油田被廢油嚴重污染的土壤，共16份。

富集培養基：酵母粉2 g/L，橄欖油10 g/L，KH2PO4 3 g/L，Na2HPO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0。

篩選培養基：酵母粉 2 g/L，橄欖油乳化液 20 g/L，（NH4）2SO4 2 g/L，NaCl 0.05 g/L，KH2PO4 0.15 g/L，Na2HPO4 0.35 g/L，瓊脂 2 g/L，羅丹明 B 0.005 g/L（過濾除菌），pH 7.0。

橄欖油與聚乙烯醇（體積分數為2%）以1∶3（體積比）的比例混合，攪動乳化5 min，即成乳白色聚乙烯醇橄欖油乳化液[7]。

種子培養基：蛋白胨2 g/L，葡萄糖 2 g/L，酵母粉 2 g/L，NaCl 3 g/L，K2HPO4 1 g/L，pH 7.0。

發酵培養基：蛋白胨2 g/L，葡萄糖 2 g/L，（NH4）2SO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，pH 7.0。

碳源篩選培養基：酵母粉2 g/L，（NH4）2SO4 2 g/L，NaCl 0.05 g/L，KH2PO4 0.15 g/L，Na2HPO4 0.35 g/L，pH 7.0，分別加入蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖作為碳源。

氮源篩選培養基：葡萄糖 2 g/L，NaCl 0.05 g/L，KH2PO4 0.15 g/L，Na2HPO4 0.35 g/L，pH 7.0，分別加入酵母粉、蛋白胨、尿素、（NH4）2SO4、KNO3作為氮源。

1.2 試驗方法

1.2.1 產脂肪酶菌種篩選

1）富集培養。每種土樣稱量5.0 g，加入20 mL無菌水，振蕩制成土壤懸液。取每種土壤懸液各5 mL加入裝有30 mL富集培養基的三角瓶中，將三角瓶置于30 ℃搖床振蕩培養3 d。富集3次。

2）初篩培養。將過濾滅菌的羅丹明B加入到已滅菌的初篩培養基中，倒平板。從富集培養的菌液中取1 mL菌液，用去離子水進行系列梯度稀釋后涂布在平板中，30 ℃培養3 d后，在350 nm紫外光下觀察，產生脂肪酶的菌株周圍會出現熒光圈，且這種熒光圈越大，脂肪酶活越高。依據培養平板上形成的熒光圈大小進行菌種篩選。

3）復篩培養。挑取初篩培養基上菌落周圍變色圈大的菌落劃線分純。分離出單菌落后斜面保存，將分純后的菌株轉接到裝有30 mL種子培養基的瓶中，30 ℃180 r/min培養24 h，然后以5% 的接種量將菌液加入到50 mL的發酵培養基中，30 ℃180 r/min培養72 h，離心得到上清液進行酶活測定。

1.2.2 酶活的測定 脂肪酶酶活的測定采用經典的聚乙烯醇橄欖油乳化液方法[8]。酶活力單位定義：30 ℃條件下，10 min油脂水解反應，每分鐘催化脂肪水解產生1 μmol脂肪酸的脂肪酶量定義為一個脂肪酶國際單位（U/mL）。

1.2.3 菌株的分子生物學鑒定 菌株基因組DNA提取的方法參考文獻[9]。16S rRNA PCR引物序列為F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R：5′- GGTTACCTTGTTACGACTT -3[引物由上生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。PCR擴增體系（50 μL）：2 × PCR Taq M 25 μL；引物F（10 μmol/L）2 μL；引物R （10 μmol/L）2 μL；DNA模板4 μL；ddH2O 17 μL。PCR反應循環體系為：94 ℃ 預變性3 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，30個循環；72 ℃ 延伸10 min。反應結束后，取10 μL PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，并將測得的序列拼接完成后登陸到NCBI BLAST中進行同源性比對。

1.2.4 產酶條件參數優化 設計單因素試驗，分別以培養基中的碳源、氮源、誘導劑和發酵條件中的溫度、初始pH、接種量、發酵時間為因素，考察發酵條件對產酶的影響，選擇對產脂肪酶菌株影響較大的5個因素，對其進行5因素4水平的正交試驗（表1），選擇其最優的組合。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

利用富集培養從被廢油長期污染的16份土樣中分離篩選得到87株能在初篩培養基中生長、有羅丹明B反應的菌株，挑取變色圈直徑與菌落直徑之比（Hc）大于1的28株菌落進行搖瓶發酵復篩，通過測定脂肪酶活，最終篩選到胞外脂肪酶活較高的8個菌株（表2），大部分初篩得到的菌株脂肪酶酶活較低，而菌株S8的初始酶活可達到10.56 U/mL，遠高于其他菌株，有很好的研究價值。

2.2 產脂肪酶菌S8的分子生物學鑒定

對菌株S8進行16S rRNA分子鑒定，采用通用引物進行PCR擴增后，獲得約1.4 kb的片段。將測序得到的序列提交至GenBank獲得登錄號：KM925079，通過BLAST與NCBI GenBank 數據庫中已報道序列進行同源性比對，結果顯示菌株S8與銅綠假單胞菌屬（Pseudomonas aeruginosa）親緣關系最近，同源性達到99%，構建系統發育樹（圖1）。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 碳源對菌株S8產脂肪酶的影響 碳源是微生物生長的重要成分，對菌體的代謝產酶有重要影響。將菌株S8在添加濃度為0.2%的不同碳源的培養基中培養，分別測定發酵液脂肪酶酶活（圖2）。由圖2可知，以麥芽糖和葡萄糖為碳源時該菌株產酶能力較高，由于成本問題，選用葡萄糖作為最佳碳源。

2.3.2 氮源對菌株S8產脂肪酶的影響 以葡萄糖為碳源，將菌株S8在添加0.2%的不同氮源的培養基中培養，分別測定發酵液脂肪酶酶活（圖3）。由圖3可知，菌株在5種氮源發酵培養基中產脂肪酶酶活大小依次為酵母粉>蛋白胨>硫酸銨>尿素>硝酸鉀，表明菌株S8對有機氮的利用優于無機氮，對銨態氮的利用優于硝態氮。因此，菌株S8的最佳有機氮源為酵母粉，無機氮源為硫酸銨。

2.3.3 誘導物對菌株S8產脂肪酶的影響 由于大多數水解酶類是誘導酶，很多微生物產生的脂肪酶也多屬于誘導酶，因此在上述碳源和氮源的基礎上添加20 g/L的不同種類的油脂作為脂肪酶的誘導劑，以考察油脂是否能有效的促進菌株S8產脂肪酶。由圖4可知，20 g/L的橄欖油對菌株產酶最有利，最大酶活可以達到19.02 U/mL，而花生油的誘導效果僅次于橄欖油，從生產成本以及購買途徑上考慮，選擇花生油作為菌株S8產脂肪酶的誘導物。

2.3.4 發酵溫度對菌株S8產脂肪酶的影響 培養溫度對發酵來說是極其重要的，溫度對菌體的生長和脂肪酶的產生的影響是各種因素的綜合表現。調節發酵溫度分別為20、25、30、35、40 ℃，研究不同發酵溫度對菌株S8發酵產酶能力的影響（圖5）。由圖5可知，隨著發酵溫度的升高，脂肪酶的酶活增大，當溫度達到30 ℃時，脂肪酶酶活最大，超過30 ℃酶活有所下降。因此，適宜菌株S8產脂肪酶的發酵溫度為30 ℃。

2.3.5 初始pH對菌株S8產脂肪酶的影響 發酵培養基起始pH對微生物生長有著密切的關系，用稀鹽酸或稀氫氧化鈉將發酵培養基調至不同的pH，發酵培養后測定脂肪酶酶活，結果表明，初始pH控制在6.0～7.5較為合適，當pH在7.0時效果最佳（圖6）。

2.3.6 接種量對菌株S8產脂肪酶的影響 將發酵培養基稀釋至107個/mL，按發酵液體積的4%、6%、8%、10%、12%和14%接種于發酵培養基中，發酵結束后測定脂肪酶酶活（圖7）。由圖7可知，脂肪酶的酶活以10%接種量為最大，這是因為過高接種量使接種的細胞數目增多，發酵培養基中的營養相對不足，細胞的生長受到抑制，影響了脂肪酶的產生。

2.3.7 發酵時間對菌株S8產脂肪酶的影響 在以葡萄糖為碳源、酵母粉和硫酸銨為氮源、花生油為誘導物、初始pH為7.0、接種量為10%、發酵溫度為30 ℃的條件下進行發酵，分別于24、48、72、96、120 h取發酵液測定脂肪酶酶活（圖8）。由圖8可知，發酵時間為72 h時，脂肪酶酶活最大，可達到26.2 U/mL。之后發酵時間再增加，由于菌體密度不斷增大，發酵培養基中營養成分減少，發酵代謝產物增多，菌株生長進入平穩期，不利于脂肪酶的產生，因此，選擇發酵時間為72 h。

2.4 正交試驗優化結果

在單因素試驗基礎上，選取碳源葡萄糖、有機氮源酵母粉、無機氮源硫酸銨、溫度和接種量5個因素，每個因素4個水平進行正交試驗，以獲得最有利菌株S8產脂肪酶的發酵參數。由正交試驗結果（表3）可知，不同的試驗因子對菌株S8發酵產脂肪酶影響次序為葡萄糖>酵母粉>硫酸銨>接種量>溫度，最佳的發酵培養條件為葡萄糖8 g/L、酵母粉8 g/L、硫酸銨6 g/L、溫度為30 ℃、接種量為9.0%。

3 小結與討論

近年來，由于石化能源的儲量逐年減少以及造成的污染日益嚴重，可再生能源受到人們的關注，尤其生物柴油以其低排放、可直接用于現有柴油機、無需進行結構的改造而備受青睞[10]，目前生產生物柴油的方法很多，但用生物酶催化合成生物柴油具有反應條件溫和、醇用量小、后處理簡單、無污染物排放，并且原料油中的FFA能完全轉化成甲酯等優點[11]。利用脂肪酶生產生物柴油在國內還處于初步研究階段，而國外一些國家已經形成規模生產[12，13]。

本研究從東營勝利油田附近的土壤中成功分離出一株脂肪酶產生菌，經16S rRNA序列分析和系統發育分析鑒定，確定為銅綠假單胞菌，命名為Pseudomonas aeruginosa S8。利用單因素和正交試驗方法確定了產脂肪酶的最佳發酵培養基為葡萄糖8 g/L、 酵母粉8 g/L、硫酸銨6 g/L，以花生油為誘導物；最佳發酵條件為起始pH 7.0、接種量9%、溫度30 ℃、發酵時間72 h。通過篩選得到的脂肪酶菌株可作為今后工業化生產的出發菌株，并為脂肪酶基因的克隆、工程菌的構建奠定基礎。

參考文獻：

[1] CHO S S，PARK D J，SIMKHADA J R，et al.A neutral lipase applicable in biodiesel production from a newly isolated Streptomyces sp.CS326[J]. Bioprocess Biosyst Eng，2012，35（1-2）：227-234.

[2] TAN T，LU J，NIE K，et al.Biodiesel production with immobilized lipase：A review[J]. Biotechnol Adv，2010，28（5）：628-634.

[3] SHARMA R，CHISTI Y，BANERJEE U C.Production，purification，characterization， and applications oflipases[J]. Biotechnol Adv，2001，19（8）：627-662.

[4] 彭立風，趙汝淇，譚天偉.微生物脂肪酶的應用[J].食品與發酵工業，2000，26（3）：68-73.

[5] 張振乾，官春云.可催化生產生物柴油脂肪酶產生菌的篩選及其培養條件研究[J].中國油脂，2009，34（1）：41-45.

[6] EISYED H，HAMED R R， KANTOUCH A. Enzyme-based feltproofing of wool[J].AATCC Rev，2002，2（1）：25-28.

[7] 肖海群.脂肪酶產生菌的選育及其發酵條件的研究[D].南昌：南昌大學，2007.

[8] ABRAMIC M， LESCIC I，KORICA T，et al. Purification and properties of extracellular lipase from Sreptomyces rimosus[J]. Enzyme Microbial Technol，1999，25（6）：522-529.

[9] 郄曉莎.低溫脂肪酶高產菌株的篩選、鑒定及其發酵產酶條件的優化[D].河北保定：河北農業大學，2007.

[10] BEALL G H， PINCHNEY L R. Nanophase glass ceramics[J]. J Am Chem Soc，1999，82（1）：5-16.

[11] 姜 楠，張 正.生物柴油的現狀與發展前景[J].世界農業，2005（3）：11-12.

[12] 李寧楊，孫佩慧，胡基埂，等.脂肪酶催化制備生物柴油的研究進展[J].中國生物工程雜志，2008，28（10）：136-140.

[13] 舒正玉，楊江科，黃 瑛.生物柴油生產用脂肪酶資源及研發現狀[J].湖北農業科學，2007，46（6）：1027-1030.