不同理化因素對重組人成纖維細胞生長因子21蛋白純度的影響

王長文，劉 敏，劉 磊，姜 勇，張 磊，李 艷，王會巖

（1.吉林醫藥學院公共衛生學院營養與食品衛生學教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫藥學院檢驗學院生物技術教研室，吉林 吉林 132013）

成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）是最新被發現的一個成纖維細胞生長因子家族的成員，屬于成纖維細胞生長因子19（fibroblast growth factor 19，FGF19） 亞族［1－3］。FGF21作為FGF家族的新成員，其具有調控多種內分泌功能［4］。研究［5－6］顯示：FGF21的功能主要表現在糖脂代謝的調節上，其可以不依賴于胰島素而使血糖降低，同時可以調節脂質代謝，緩解脂肪肝動脈粥樣硬化。近年來在國際上FGF21已成為糖尿病、脂肪肝、肥胖癥和代謝綜合征等代謝疾病研究的熱點藥物，未來有可能替代胰島素成為治療糖尿病的新藥［7－8］。最新研究［9］表明：FGF21能夠保護心肌細胞免受氧化應激帶來的損傷。美國Lilly公司已開展FGF21的Ⅱ期臨床觀察［10］。但對重組人FGF21（rhFGF21）的穩定性研究目前未見報道。本實驗利用已構建的高表達FGF21蛋白基因工程菌株，經發酵純化后，獲得純度大于95%的蛋白［11－12］，對其穩定性做進一步觀察和測定，以便為制定rhFGF21的質量標準提供依據，也可為其他蛋白質類藥物的開發和生產提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 三氟乙酸和乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純；rhFGF21原液由吉林醫藥學院王會巖博士提供，純度＞99%。高效液相色譜儀（E2695，紫外檢測器，美國 Waters公司）。

1.2 不同溫度時rhFGF21純度檢測 將一定數量的樣品放置于25℃、4℃和－20℃下保存，對4℃和25℃樣品每周取樣品若干支進行外觀形狀觀察和HPLC法檢測rhFGF21純度，－20℃樣品保存12個月，每6個月取樣品3支進行檢測，同時觀察外觀性狀。

1.3 不同緩沖體系和pH值時rhFGF21純度檢測緩沖體系終濃度為20mmol·L－1，蛋白水平為0.5g·L－1，醋酸－醋酸鈉緩沖液pH 4.0和pH 5.0、檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液pH 5.0和pH 6.0、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液pH 6.0、pH 6.5和pH 7.0及Tris－HCl緩沖液pH 7.5和pH 8.0，分別于每7d取3支樣品觀察rhFGF21原液的外觀性狀變化并對其純度進行測定。

1.4 反復凍融處理后rhFGF21純度檢測 將一定數量rhFGF21原液于－20°C凍存，每日固定時間將其融化，然后置于－20°C凍存，如此重復持續12d，每3d觀察rhFGF21原液外觀性狀的變化并對其純度進行測定。

1.5 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理。rhFGF21純度檢測結果以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 色譜條件 色譜柱為C18柱（250×4.6mm，5μm）；流動相：A 相為0.1%三氟乙酸－注射用水；B相 為A甲醇，C和D相均為水；流速0.5mL·min－1；檢測波長280nm；平衡用100%A泵液體至基線穩定，洗脫采用不同濃度梯度A泵逐級洗脫，進樣量 10μL。rhFGF21原液HPLC色譜圖見圖1。

2.2 不同溫度時rhFGF21的純度 25℃時，存放14d時rhFGF21純度（15.20%±0.14%）較0d時（100.00%±0.00%）下降，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。4℃ 時，存放35d時rhFGF21純度下降至（89.30±0.39）%，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。－20℃時，存放6個月時rhFGF21純度下降至（99.10±0.39）%，與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；存放12個月時rhFGF21純度下降至（95.30±0.39）%，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 rhFGF21原液HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of rhFGF21original fluid

2.3 不同緩沖體系和pH值時rhFGF21純度25℃條件下rhFGF21在不同pH值的緩沖體系中保存7d后，pH 4.0和pH 5.0的醋酸－醋酸鈉緩沖液出現渾濁，rhFGF21純度分別下降至（30.60±0.12）%和（45.60± 0.30）%；pH 5.0和pH 6.0檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液出現渾濁，純度降至（55.90±0.90）%和（65.90±0.82）%；pH 6.0、pH 6.5和pH 7.0磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液中，pH 6.0緩沖液渾濁，純度為（71.10±0.65）%，pH 6.5和pH 7.0磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液澄清透明，純度為（75.10±0.45）%和（80.50± 0.02）% ；pH 7.5和pH 8.0Tris－HCl緩沖液中，pH 7.5緩沖液澄清透明，純度為（81.50±0.22）%和（78.40±0.37）%。以上不同pH 值的緩沖液保存后，與對照組（100.00%±0.00%）比較，rhFGF21純度差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 反復凍融后rhFGF21的純度 rhFGF21原液反復凍融后，肉眼觀察的結果和純度檢測一樣，0～3d瓶內液體仍澄清，無不溶物出現，反復凍融3d后，rhFGF21純度 ［（90.80±0.01）%］與對照組［0d，（100.00±0.00）%］比較差異無統計學意義（P＞0.05）；6～12d時，發現肉眼可見的不溶物；反復凍融6、9和12d后rhFGF21純度分別為（90.80±0.01）%、（82.5±0.02）%和（70.6±0.02）%，與對照組（0d）比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

隨著基因工程技術的發展，在臨床治療上蛋白質藥物已得到大量應用，然而由于蛋白質穩定性不好，易失去活性，限制了部分蛋白質藥物的應用。眾所周知，蛋白質在水溶液中穩定性較差，這是由于蛋白質在水溶液中容易發生物理或化學方面的某些變化。某些物理因素如溫度、離子強度、渦流、表面吸附和化學降解及修飾作用等均會增加疏水表面積從而影響蛋白質的聚合行為，導致蛋白質的活性降低甚至消失、溶解性的降低和免疫原性的改變［13］。最新研究［14－15］表明：聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾、pH值敏感型聚合物水凝膠等均可提高蛋白質的穩定性。

雖然溫度是影響蛋白質和多肽穩定性最重要的因素，但其影響機理尚未明確。通常認為：溫度越高，蛋白質的穩定性越差。本研究中rhFGF21在水溶液中隨著溫度的升高穩定性下降，可能是由于高溫使其化學降解過程加速。由于蛋白質在胞內處于中性環境中，非常穩定。但當純化后在水溶液中穩定性較差。本研究結果顯示：rhFGF21的穩定性在pH 6.5～8.0溶液中優于酸性或堿性溶液，而且表現出酸性越強其穩定性越差的趨勢，極端的pH值會降低鹽橋的形成能力，從而導致其穩定性上的降低。

一些蛋白質對溶液的反復凍融很敏感［16］。本研究中rhFGF21對凍融非常敏感，在以后的生產中要盡量避免反復凍融。

綜上所述，rhFGF21于低溫和pH 6.5～8.0接近中性條件下呈現出較好的穩定性。而高溫、偏酸性和偏堿性條件對rhFGF21的穩定性不利。磷酸鹽緩沖液對rhFGF21穩定性呈現出較好的作用。反復凍融處理對rhFGF21穩定性具有明顯的影響。本實驗結果將為rhFGF21純化工藝的研究、rhFGF21質量標準制定和蛋白質藥物制劑開發提供依據。

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