聯麥氧釩對糖尿病大鼠內質網應激介導心肌細胞凋亡的抑制作用及其機制

李 穎，叢曉強，趙良臣，謝 林，劉 婭

（1.吉林省人民醫院急診內科，吉林 長春 130021；2.吉林大學第一醫院心內科，吉林 長春 130021；3.吉林省吉林市中心醫院心內科，吉林 吉林 132011；4.吉林大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室，吉林 長春 130021）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種在世界范圍流行的重要疾病，已成為嚴重影響我國國民健康的公共衛生問題。最新數據［1］顯示：截至2012年中國DM患病人數已達9240萬以上，居世界第一，DM前期患者已高達1.48億，預計到2030年中國DM患者將增至約1.3億。目前DM已成為人類第4大死亡原因，占全球總死亡率的6.8%［2］。1974年糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）的概念被首次提出，其是獨立于高血壓、冠心病和心臟瓣膜病的心肌病，目前認為是導致DM患者死亡的主要原因［3］。釩是一種具有獨特化學性質和生物活性的人體必需微量元素，聯麥氧釩 ［bis（maltolato）oxovandium，BMOV］是一種有機釩絡合物，研究［4－5］顯示：BMOV可促進糖原合成，增加肌肉、脂肪等胰島素敏感組織對葡萄糖的攝取和利用，并對胰島素抵抗和高胰島素血癥造成的靶器官如心肌、視網膜有一定的保護作用。在胰島β細胞中釩通過對內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的調節抑制細胞凋亡，因而有理由假設釩可能參與調節心肌細胞中ERS介導的細胞凋亡，從而起到保護心肌細胞的作用。本實驗通過構建大鼠DM模型，給予飲水中加入BMOV，探討BMOV對DM大鼠ERS介導的心肌細胞凋亡的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 健康雄性清潔級Wistar大鼠35只，體質量200～220g，購于吉林大學實驗動物部；將大鼠置于吉林大學公共衛生學院毒理學研究所飼養，每籠2只，室溫控制在17～21℃，控制晝夜光照。飼料購自吉林大學實驗動物中心；BMOV購自上海笛柏化學品技術有限公司，產品編號H 129021；鏈脲佐霉素（STZ）購自美國Sigma公司；TUNEL試劑盒購自銳博生物有限公司；GADPH、葡萄糖調節蛋白78（GRP78）抗體購自英國Abcam公司，CCCAAT／增強子結合慢白同源蛋白（CHOP）抗體發光試劑購自上海碧云天生物試劑公司；X盒結合蛋白1（XBP－1）抗體購自美國Sigma公司；qPCR引物為上海生工合成；qPCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。UV－265可見－紫外光分光光度計（日本島津公司）。

1.2 實驗分組、模型建立和給藥 對照組：隨機取10只大鼠腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液（pH 4.5，濃度0.1mmol·L－1）＋正常飲水＋常規喂養，維持4周。其余25只大鼠一次性腹腔注射STZ建立DM動物模型［6］，濃度為40g·L－1，劑量為55mg·kg－1，1周后檢測大鼠空腹的尾靜脈血糖，血糖≥13.3mmol·L－1定為 DM 大鼠，STZ誘導過程中5只大鼠未達DM成模標準，予以剔除，取成模20只大鼠隨機分為DM組和BMOV組，每組10只。DM組大鼠正常飲水＋常規喂養，繼續維持3周；BMOV組大鼠飲水中加入BMOV（將BMOV溶解在飲水中，起始飲水中BMOV 濃度為 0.25g· L－1，每3d增加0.25g·L－1，第9天達最高濃度1g·L－1，保持不變）＋常規喂養，共維持3周［7］。

1.3 TUNEL染色觀察大鼠心肌組織細胞凋亡情況 大鼠在3%戊巴比妥30mg·kg－1腹腔注射麻醉后，取左心室心肌組織，取一部分10%甲醛固定2d后行預處理，按試劑盒說明書，將組織切片脫蠟，梯度酒精浸洗，Proteinase K工作液透化，在切片上加TUNEL反應液，蓋膜，37℃孵育60min，PBS緩沖液沖洗3次，DAB室溫顯色10min，PBS洗滌3次，每次5min，梯度酒精脫水、透明和封片，于光鏡下觀察，每只大鼠3張切片，每個切片隨機計數無重疊具有代表性的5個400倍視野，以平均每100個細胞核中含凋亡細胞數量作為心肌細胞凋亡指數（apoptosis index，AI）［8－9］。

1.4 Western blotting法檢測心肌組織中GRP78、CHOP和XBP－1表達水平 取部分新鮮左心室心肌組織，液氮研磨組織至單細胞狀態，加入裂解液（每10mg組織加入200μL，含PMSF），冰上裂解30min；4℃、12000r·min－1，離心15min，取上清，考馬斯亮藍G250測定蛋白質溶液的吸光度（A）值，調整樣品的蛋白濃度，使各個樣品的濃度在同一水平（4～8g·L－1）。實驗采用不連續系統蛋白質SDS－PAGE，濃度為5%濃縮膠和15%濃度分離膠；每孔上樣40～60μg總蛋白，蛋白質相對分子質量標準為普通Marker，相對分子質量范圍為16000～220000。實驗選用Bio－Rad的標準濕式轉膜裝置及PVDF膜，轉膜完畢后，TBST溶液中漂洗1～2min，5%脫脂奶粉封閉液，室溫，50r·min－1，封閉60min。孵育一抗：根據蛋白Marker指示將PVDF膜剪開，參考一抗說明書，按1∶1000（GRP78）、1∶1500（CHOP）和1∶1000（XBP－1）比例稀釋一抗；將PVDF膜分別放入含各自一抗溶液中，4℃孵育一抗過夜。孵育二抗：參考二抗說明書加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶5000比例稀釋），室溫搖動孵育1h。使用BeyoECLPlus化學發光試劑，黑暗處顯色，用X光片壓片，顯影液和定影液洗片。

1.5 qPCR法檢測XBP－1mRNA表達水平 取部分新鮮冰凍左心室心肌組織，采用Trizol法提取總RNA，參考TaKaRa PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（D6210A）試劑盒說明書進行反轉錄。XBP－1引物序列為上游：5′－AGTTAAGGACACGCTTGGGG－3′，下游：5′－ACGTAGTCTGAGTGCTGCG－3′。內參 GAPDH 的引物序列為上游：5′－CACTCAGAAGACTGTGG－3′，下游：5′－TTCAGCTCTGGGATGACCTT－3′。反轉錄合成cDNA，反應參數參考TaKaRa SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）試劑盒說明進行，Real－Time PCR的擴增曲線和融解曲線應用 Bio－Rad CFX96Real－Time PCR System的操作方法進行，以目的基因XBP－1與內參照基因GADPH值的比值表示目的基因相對表達水平。

1.6 統計學分析 采用SPSS 13.0及Excel 2010軟件進行統計學處理。各組大鼠體質量、空腹血糖水平、 AI和GRP78、 CHOP、 XBP－1、XBP－1mRNA表達水平均以表示，組間兩兩比較采用Student－Newman－Keuls檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠基本情況 對照組：整個實驗過程中對照組大鼠生長及精神狀態良好，體質量明顯增加，空腹血糖正常，皮毛色澤正常，反應敏捷。DM組：大鼠腹腔注射STZ成模后逐漸出現多飲、多尿、多食和消瘦（三多一少）等癥狀，與對照組比較，第2～4周大鼠體質量降低（P＜0.05），血糖明顯升高（P＜0.05），精神萎靡，皮毛臟亂無光澤。BMOV組：大鼠腹腔注射STZ成模后，第2周飲水中加入BMOV，大鼠多飲、多尿、多食和消瘦癥狀較DM組明顯好轉，第2～4周大鼠體質量明顯增加（P＜0.05），血糖明顯下降（P＜0.05），精神尚可，皮毛干枯。見表1和2。

表1 各組大鼠體質量Tab.1 Body weights of rats in various groups （n＝10，，m／g）

表1 各組大鼠體質量Tab.1 Body weights of rats in various groups （n＝10，，m／g）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with DM group.

1 2 3 4 Control 216.60±8.20 295.40±13.00 331.36±18 Group Body weight（week）.14 365.17±15.63 DM 213.54±7.20 178.09±13.98＊ 175.30±14.42＊ 185.94±15.99＊BMOV 214.87±7.36 236.18±16.87＊△ 248.04±20.99＊△ 262.66±20.13＊△

表2 各組大鼠空腹血糖水平Tab.2 Levels of fasting glucose of rats in various groups ［n＝10，，cB／（mmol·L－1）］

表2 各組大鼠空腹血糖水平Tab.2 Levels of fasting glucose of rats in various groups ［n＝10，，cB／（mmol·L－1）］

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with DM group.

1 2 3 4 Control 5.18±0.36 5.35±0.36 5.47±0.29 5.21±Group Fasting glucose（week）0.35 DM 23.66±3.16 26.71±3.05＊ 27.94±1.91＊ 29.22±2.89＊BMOV 24.02±3.21 18.60±2.08＊△ 16.51±0.67＊△ 16.26±1.09＊△

2.2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況 TUNEL法檢測結果顯示：對照組大鼠心肌組織中見極少的凋亡細胞（細胞核呈棕黃色為凋亡細胞，呈淡藍色為正常細胞），AI為（0.80±0.63）%；DM組AI為（9.10±1.79）%；BMOV組AI 為（5.20±1.75）%。與對照組比較，DM組和BMOV組大鼠心肌細胞AI明顯升高（P＜0.05）；與DM組比較，BMOV組大鼠心肌細胞AI明顯下降（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠心肌組織中 GRP78、CHOP和XBP－1表達水平 與對照組比較，DM組和BMOV組大鼠心肌組織中GRP78、CHOP和XBP－1表達水平明顯升高（P＜0.05）；與DM組比較，BMOV組大鼠心肌組織中GRP78、CHOP和XBP－1表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中GRP78、CHOP和XBP－1表達水平Tab.3 Expression levels of GRP78，CHOP，and XBP－1in myocardium tissue of rats in various groups（n＝10，）

表3 各組大鼠心肌組織中GRP78、CHOP和XBP－1表達水平Tab.3 Expression levels of GRP78，CHOP，and XBP－1in myocardium tissue of rats in various groups（n＝10，）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with DM group.

GRP78 CHOP XBP－1 Group 2 Control 0.106±0.0110.274±0.0220.361±0.02 DM 0.207±0.014＊0.530±0.065＊0.499±0.055＊BMOV 0.153±0.010＊△0.364±0.031＊△0.419±0.032＊△

2.4 各組大鼠心肌組織中XBP－1mRNA表達水平與對照組（1.00±0.21）比較，DM組（3.10±0.29）和BMOV組（2.60±0.24）大鼠心肌組織中XBP－1mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）；與DM組比較，BMOV組XBP－1mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）。

3 討 論

DCM 是一個長期而 復雜的病理過程［10－11］，其由能量代謝異常導致細胞內質網、線粒體和肌原纖維等損傷，最終導致心肌細胞肥大和凋亡增加，進一步加重DCM過程中心肌重構與功能障礙。內質網存在于所有真核細胞中，是真核細胞蛋白質、膽固醇、脂類合成、信號轉導、信號肽識別及鈣穩態維持的亞細胞器，參與新合成的分泌性蛋白和跨膜蛋白的糖基化修飾、折疊、寡聚化等過程，對細胞內環境變化極度敏感。當細胞在高糖誘導下，能量代謝紊亂，內環境穩態受到破壞，內質網內未折疊蛋白過度蓄積，極易觸發ERS［12］。XBP－1是ERS中非折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）元件重要的轉錄調控因子，當細胞發生ERS時，內質網腔內重要跨膜蛋白分子IRE1與GRP78分離，發生寡聚糖化、自身磷酸化而激活，誘 導 XBP－1mRNA特異性剪接，產生XBP－1smRNA，編碼XBP－1s蛋白，進入細胞核中與ERS反應順式作用元件結合，在轉錄水平上調控ERS相關基因的表達，啟動相關的細胞凋亡信號［13－14］。

近年研究［15－16］顯示：釩化合物具有明確的類胰島素樣活性，是一種很有前途的降糖藥物，其對DM大鼠的心肌損害和心功能具有明顯的保護作用，其可能的作用機制一直是研究的熱點和爭論的焦點。本研究中BMOV組大鼠血糖水平較DM組明顯降低，表明BMOV有降血糖作用；經TUNEL染色后DM組大鼠心肌細胞凋亡較對照組明顯增加，GRP78、CHOP和XBP－1蛋白表達水平升高，XBP－1mRNA表達上調，表明在DM大鼠中ERS及其介導的細胞凋亡參與DCM的發生發展過程，并能夠加重心肌細胞損傷；BMOV組大鼠心肌細胞AI較DM組明顯降低，GRP78、CHOP和XBP－1表達明顯降低，XBP－1mRNA表達下調，表明BMOV對DM大鼠心肌細胞具有保護作用，其作用機制可能與抑制心肌細胞ERS及其介導的細胞凋亡有關聯［17－18］，但是否是通過降低血糖實現的，尚需進一步研究。

本研究結果提示：臨床針對DCM的治療，除了有效控制血糖外，更應進一步探尋潛在的、多層次的、多通路的聯合治療策略，減輕DM患者心肌病變的損傷。對于早期DM患者，可以考慮適當增加富含釩類食物如海鮮等的攝入，以改善患者的預后，提高其長期生存率。

［1］Yang W，Lu J，Weng J，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China ［J］.New Engl J Med，2010，362（12）：1090－1101.

［2］Roglic G，Unwin N.Mortality attributable to diabetes：estimates for the year 2010 ［J］.Diabetes Res Clin Pract，2010，87（1）：15－19.

［3］Cai L，Li W，Wang G，et al.Hyperglycemia－induced apoptosis in mouse myocardium：mitochondrial cytochrome C－mediated caspase－3activation pathway ［J］.Diabetes，2002，51（6）：1938－1948.

［4］王秋利，孔 儉，李 杰，等.聯麥氧釩對糖尿病大鼠晶體超微結構的影響 ［J］.中華醫學雜志，2000，80（4）：77－78.

［5］孫 捷，丁怡敏，邵明柏，等.聯麥氧釩對自發性高血壓大鼠心肌結構的影響 ［J］.吉林大學學報：醫學版，2005，31（3）：398－400.

［6］Pawson EJ，Duran－Jimenez B，Surosky R，et al.Engineered zinc finger protein－mediated VEGF－a activation restores deficient VEGF－a in sensory neurons in experimental diabetes［J］.Diabetes，2010，59（2）：509－518.

［7］Wasan KM，Risovic V，Yuen VG，et al.Effects of three and eight weeks oral administration of bis（maltolato）oxovanadium（IV）on plasma homocysteine and cysteine levels in streptozotocin－induced diabetic rats ［J］.Exp Clin Cardiol，2004，9（2）：125－129.

［8］韋金儒，張雅莉.3－硝基酪氨酸與糖尿病心肌病大鼠心肌細胞凋亡的關系研究 ［J］.中國病理生理雜志，2011，27（2）：243－248.

［9］王時俊，鄒云增，孫愛軍，等.氧化應激在乙醛引起的心肌細胞凋亡中的作用 ［J］.中國病理生理雜志，2008，24（8）：1464－1468.

［10］Chen J，Zhang Z，Cai L.Diabetic cardiomyopathy and its prevention by nrf2：current status ［J］.Diabetes Metab J，2014，38（5）：337－345.

［11］Bugger H，Abel ED.Molecular mechanisms of diabetic cardiomyopathy ［J］.Diabetologia，2014，57（4）：660－671.

［12］Sozen E，Karademir B，Ozer NK.Basic mechanisms in endoplasmic reticulum stress and relation to cardiovascular diseases ［J］.Free Radic Biol Med，2014，78（1）：30－41.

［13］Liu Y，Adachi M，Zhao S，et al.Preventing oxidative stress：a new role for XBP1 ［J］.Cell Death Different，2009，16（6）：847－857.

［14］Huang CC，Li Y，Lopez AB，et al.Temporal regulation of Cat－1（cationic amino acid transporter－1）gene transcription during endoplasmic reticulum stress ［J］.Biochem J，2010，429（1）：215－224.

［15］Ozturk N，Olgar Y，Ozdemir S.Trace elements in diabetic cardiomyopathy：An electrophysiological overview ［J］.World J Diabetes，2013，4（4）：92－100.

［16］Clark TA，Deniset JF，Heyliger CE，et al.Alternative therapies for diabetes and its cardiac complications：role of vanadium ［J］.Heart Fail Rev，2014，19（1）：123－132.

［17］田 慧.糖尿?。号孕难懿∽冎匾ｋU因素 ［J］.中國實用內科雜志，2014，34（1）：18－21.

［18］金 茜，李小鳳.糖尿病患者認知功能減退相關危險因素研究進展 ［J］.中國實用內科雜志，2013，33（3）：243－245.