PDGF／ROCK通路在AcSDKP抑制大鼠矽肺纖維化形成中的作用

張麗娟，李 倩，徐 洪，李淑鈺，裴 鑫，張文麗，楊 方

（華北理工大學醫學實驗研究中心 華北理工大學老年醫學國際科技合作基地，河北 唐山 063000）

塵肺病是我國最嚴重的職業病，2013年塵肺病報告病例數占職業病報告總例數的87.72%，給國家、社會和群眾健康帶來了極大的危害［1］。而目前尚無治療塵肺病的特效方法。塵肺病以肺組織的彌漫性纖維化為其主要病理特征，探索塵肺病發病的分子機制以延緩或阻斷肺纖維化的發展進程仍具有重要的實際意義。在矽肺形成過程中，吞噬二氧化硅（SiO2）的肺泡巨噬細胞可釋放大量細胞因子，包括轉化生長因子β（transforming growth factor－β，TGF－β），血小板源性生長因子（platelet－derived growth factor，PDGF）等，其中TGF－β／Smad促進肌成纖維細胞轉化構成了器官纖維化發病過程中一個較為明確的機制［2－5］。肌成纖維細胞已經被認為是器官纖維化最主要和最重要的效應細胞，特異表達α－平滑肌肌動蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）［6－7］。研究［8－9］顯示：Rho－ROCK信號通路可通過復雜的磷酸化／脫磷酸化級聯反應調控α－SMA的表達，但其具體機制仍有待進一步研究。本研究探討肺纖維化過程中Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho－associated coiledcoil－forming protien kinase，ROCK）和另一重要的促纖維化因子—PDGF在肌成纖維細胞轉化以及矽肺大鼠肺組織內膠原沉積中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康成年雄性Wistar大鼠60只，體質量（180±10）g，購于北京維通利華動物技術有限公司，動物許可證號：SLXK京20090008于河北聯合大學實驗動物中心屏障實驗室飼養，溫度20～26℃，濕度50%～70%，晝夜交替，自由飲食進水。

1.2 材料、主要試劑和儀器 標準α石英粉塵（中國疾病預防控制中心）。AcSDKP（瑞士Bachem AG公司），兔抗大鼠α－SMA 、ROCK、PDGFR－β和phospho－PDGFR－β多克隆抗體（美國Epitomics公司），小鼠抗大鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原單克隆抗體（美國Sigma公司），兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗、DAB顯色試劑盒和BCIP／NBT顯色試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。藥物釋放微滲泵（美國DURECTCorporation公司）。

1.3 矽肺動物模型建立［10］將大鼠隨機分為6組，每組10只，乙醚麻醉后采用非暴露式氣管插管，按照實驗分組支氣管內一次性灌注生理鹽水或濃度為50g·L－1的生理鹽水SiO2混懸液。①模型對照4周組：大鼠支氣管內灌注滅菌生理鹽水1.0mL／只，腹腔內埋入注入生理鹽水的微量藥物釋放泵，4周后處死；②模型對照8周組：同模型對照4周組處理后于8周后處死；③矽肺模型4周組：大鼠支氣管內灌注SiO2混懸液1.0mL／只，腹腔內埋入注入生理鹽水的微量藥物釋放泵，4周后處死；④矽肺模型8周組：同矽肺模型4周組處理后于8周后處死；⑤N－乙?；z氨酰－天門冬酰－賴氨酰－脯氨酸（N－acetyl－seryl－aspartyl－lysylproline，AcSDKP）治療組：支氣管內灌SiO2混懸液1.0mL／只，4周后腹腔內埋入含有AcSDKP（800μg·kg－1·d－1）的微量藥物釋放泵，4周后處死；⑥AcSDKP預防治療組，先于腹腔內埋入含有AcSDKP的微量藥物釋放泵48h，而后支氣管內灌SiO2混懸液1.0mL／只，持續至8周后處死。各組大鼠腹主動脈采血后處死取肺組織，右下葉肺組織經多聚甲醛固定后常規石蠟包埋以備免疫組織化學染色，其余肺組織迅速凍于液氮中保存以備Western blotting檢測。

1.4 免疫組織化學染色法檢測大鼠肺組織中phospho－PDGFR－β的表達 染色步驟按免疫組織化學試劑說明書進行，其中phospho－PDGFR－β抗體滴度為1∶150，實驗中設置陰性對照（PBS替代一抗）。采用專業圖像分析軟件Image－pro plus進行圖像采集。

1.5 Western blotting法檢測大鼠肺組織中α－SMA、PDGFR－β、phospho－PDGFR－β和ROCK以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達水平 按照文獻 ［11］的方法提取并測定蛋白濃度后，每孔90μg上樣，SDS－PAGE電泳并轉膜。采用5%的牛血清白蛋白37℃封閉1h，一抗（PDGFR－β、phospho－PDGFR－β抗體、Ⅰ型和Ⅲ型膠原抗體1∶1000稀釋；α－SMA 抗體、ROCK 抗體和β－actin抗體1∶500稀 釋），4℃ 孵育過夜；二抗（1∶3000稀釋）37℃ 孵育1h；堿性磷酸酶顯色。用圖像掃描后以Image J軟件對蛋白表達條帶進行吸光度（A）值的定量分析，目的蛋白條帶A值經內參平衡后，以各組A值與模型對照4周組A值的比值作為蛋白相對表達水平。

1.6 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理。各組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、Rock、α－SMA 以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達水平均以表示，組間樣本均數比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠肺組織中phospho－PDGFR－β蛋白的表達 免疫組織化學染色結果顯示：在模型對照4和8周組，phospho－PDGFR－β陽性表達細胞散在分布于肺泡壁；而在矽肺模型4和8周組，可見較多phospho－PDGFR－β陽性表達的細胞分布在矽結節與間質纖維化區域。當給予AcSDKP干預治療時，phospho－PDGFR－β蛋白表達無論是從分布面積還是染色強度來看，phospho－PDGFR－β陽性表達細胞均明顯減少。見圖1（插頁四）。

2.2 各組大鼠肺組織 中 PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA蛋白表達水平 與模型對照組比較，矽肺模型組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA蛋白表達水平增強。其中矽肺模型4周組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA蛋白表達水平分別為模型對照4周組的2.01、3.89、2.46和1.53倍，矽肺模型8周組大鼠肺組織 中 PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA蛋白表達水平分別為模型對照8周組的1.99倍、3.81倍、2.07 倍和1.48倍。AcSDKP治療組和AcSDKP預防治療組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA蛋白表達水平均較矽肺模型組降低，其中AcSDKP治療組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA 蛋白表達水平分別為矽肺模型4周組的80.60%、47.30%、60.57%和84.96%，為矽肺模型8周組 的69.50%、 47.79%、 73.40%和86.09%；AcSDKP預防治療組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK和α－SMA 蛋白表達水平為矽肺模型8周組的 73.40%、45.97%、69.46%和84.11%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1和圖2。

2.3 各組大鼠肺組織中Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原蛋白表達水平 Western blotting法結果顯示：與模型對照組比較，矽肺模型組大鼠肺組織中Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原蛋白表達增強。其中矽肺模型4周組大鼠肺組織中Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達水平（以灰度值表示）分別為模型對照4周組的1.73和1.99倍，矽肺模型8周組大鼠肺組織中Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達水平分別為模型對照8周組的1.97和2.02倍。AcSDKP治療組和AcSDKP預防治療組大鼠肺組織中Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達均較矽肺模型組表達減弱，其中AcSDKP治療組Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白表達水平分別為矽肺模型4周組的81.50%和66.83%，為矽肺模型8周組 的78.77%和61.00%；AcSDKP預防治療組大鼠肺組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達水平為矽肺模型8周組的83.79%和63.30%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1和圖2。

3 討 論

矽肺病是長期吸入二氧化硅粉塵所致的以肺組織彌漫性纖維化和矽結節形成為主要病理改變的常見職業病。在矽肺形成過程中，被激活的內皮細胞、吞噬二氧化硅的肺泡巨噬細胞等可釋放大量的細 胞因子（包括TGF－β和PDGF等）。TGF－β和PDGF在矽肺病患者血清中的水平明顯升高［2］。ROCK通過控制細胞骨架肌動蛋白的排列和細胞收縮調節細胞的黏附、遷徙、增殖和凋亡，在器官纖維化的發生和發展過程中發揮著重要作用［12－13］。本課題組前期研究［14］證實：TGF－β可以通過激活ROCK信號通路刺激大鼠肺成纖維細胞向肌成纖維細胞分化。PDGFR－β屬酪氨酸激酶受體，能夠被PDGF激活并和EGFR形成異二聚體，配體結合能誘發受體的二聚化并激活受體胞質部分的酪氨酸激酶，催化ATP的γ－磷酸基轉移至受體的酪氨酸磷酸并并影響細胞的生長、肌動蛋白重塑、遷移和分化［16－17］。徐惠等［18］在研究中發現：單側輸尿管梗阻模型大鼠腎間質中α－SMA和Ⅲ型膠原的表達與腎小管PDGFR－β和PDGF－BB的表達呈正相關。以上研究結果提示：PDGF／ROCK通路可能在矽肺大鼠肺纖維化過程中發揮著重要作用。

表1 各組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK、α－SMA以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of PDGFR－β，phospho－PDGFR－β，ROCK，α－SMA，typeⅠcollagen，and typeⅢcollagen in lung tissue of rats in various groups （n＝10，）

表1 各組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK、α－SMA以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of PDGFR－β，phospho－PDGFR－β，ROCK，α－SMA，typeⅠcollagen，and typeⅢcollagen in lung tissue of rats in various groups （n＝10，）

Quantitative data was as fold for model control 4weeks group.＊P＜0.05 vs model control 4weeks group；△P＜0.05 vs model control 8weeks group；#P＜0.05 vs silicosic model 4weeks group；▲P＜0.05 vs silicosic model 8weeks group.

Group PDGFR－β phospho－0±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 Model control 8weeks 1.17±0.17 1.01±0.11 0.98±0.10 1.02±0.09 0.91±0.08 1.08±0.15 Silicosic model 4weeks 2.01±0.13＊ 3.89±0.19＊ 2.46±0.41＊ 1.53±0.07＊ 1.73±0.24＊ 1.99±0.15＊Silicosic model 8weeks 2.33±0.17△ 3.85±0.23△ 2.03±0.28△ 1.51±0.07△ 1.79±0.14△ 2.18±0.27△AcSDKP post－treatment 1.62±0.15#▲ 1.84±0.17#▲ 1.49±0.20#▲ 1.30±0.10#▲ 1.41±0.07#▲1.33±0.13#▲AcSDKP pre－treatment 1.71±0.12# 1.77±0.19# 1.41±0.04# 1.27±0.09# 1.50±0.11# 1.38±0.17 en Model control 4weeks 1.00±0.00 1.00±0.00 1.0 PDGFR－β ROCK α－SMA TypeⅠcollagen TypeⅢcollag#

圖2 Western blotting法檢測各組大鼠肺組織中PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK、α－SMA、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of PDGFR－β，phospho－PDGFR－β，ROCK，α－SMA，typeⅠcollagen，and typeⅢcollagen in lung tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

本研究觀察了PDGFR－β、phospho－PDGFR－β、ROCK、α－SMA以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白在矽肺模型大鼠肺組織中的表達，結果再次證實了本課題組的前期研究［6］結果，即AcSDKP可降低矽肺大鼠肺組織內Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達。而與此同時，本文作者發現：矽肺模型組矽結節與間質纖維化區域有較多phospho－PDGFR－β陽性表達細胞分布。當給予 AcSDKP干預治療時phospho－PDGFR－β蛋白表達無論是從分布面積還是染色強度來看，均明顯減少。此外，Western blotting結果也進一步證實，當給予AcSDKP干預治療時，大 鼠 肺組織 中 α－SMA、PDGFR－β、phospho－PDGFR－β和ROCK表達水平均較矽肺模型組明顯降低。提示PDGF可能通過激活ROCK信號轉導通路促進大鼠肌成纖維細胞轉化，進而促進矽肺大鼠肺組織內膠原的合成。AcSDKP可能通過抑制PDGF／ROCK誘導的肌成纖維細胞分化，減少膠原的合成，進而發揮抗矽肺纖維化的作用。

本研究進一步探討了AcSDKP抗矽肺纖維化的可能作用機制，但矽肺的形成過程是復雜的細胞因子網絡相互作用的結果，因此AcSDKP對其他細胞因子以及在細胞因子 “對答”中的作用仍需進一步探討。

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