Nucleolin與VEGF在結腸癌中的表達及其與轉移的關系

林 冰，雷 晴，郎錦義，王春婷

(1．成都中醫藥大學附屬醫院，成都610000;2．四川省腫瘤醫院，成都610041;3．四川大學，成都610000)

結腸癌是危害人類健康的常見消化道惡性腫瘤，全球結直腸癌發病率平均每年以2%速率遞增，老年人多見，但青少年也有逐年增多的趨勢［1］。在我國，隨著人民生活水平的不斷提高，結腸癌的發病率也在逐年增加，呈明顯上升趨勢，目前結腸癌已成為我國重點防治的腫瘤之一。結腸癌的發生、發展、浸潤及轉移機制非常復雜，包括癌基因的突變和過度表達，抑癌基因的缺失或突變等因素在結腸癌的演變過程中都起到了重要作用［2］。

血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種特異作用于內皮細胞的多功能因子，在正常組織中表達水平較低，但是在許多腫瘤組織中表達水平較高，在腫瘤血管生成過程中起重要作用［3］。

Nucleolin廣泛存在于真核細胞的細胞核中，作為一個多功能核蛋白，參與調節細胞增殖，胞質分裂，細胞復制，胚胎發生等生命過程［4］。同時，Nucleolin在部分腫瘤細胞及內皮細胞表面也呈高表達，近期的研究表明細胞膜表面的nucleolin參與腫瘤的發生發展過程［5］。此外，nucleolin與腫瘤發生及血管生成相關的一系列的配體結合，如hepatocyte growth factor、endostatin、tumor-homing peptide F3 、laminin、P-selectin、midkine等，通過功能性阻斷以及下調細胞膜表面的nucleolin，抑制內皮細胞的遷移及血管生成，并引起內皮細胞的凋亡［6］。有研究表明，nucleolin的核定位水平越高，膜定位水平越低，胰腺癌病人的預后越好，表明細胞膜表面的nucleolin可能作為一個潛在的腫瘤治療靶點［7］。

本文運用組織芯片技術，檢測Nucleolin蛋白在正常組織、結腸癌組織和淋巴結、肝臟轉移性結腸癌組織中的表達情況，探討其與結腸癌病理分級、臨床分期之間的關系，及相關信號通路。

1 材料和方法

1．1 研究對象

組織芯片 結腸癌組織芯片(BC05115)購自陜西艾麗娜生物科技公司，含有結腸癌，結腸癌肝轉移，結腸癌淋巴結轉移及各類組織微陣列，其中結腸癌30例，結腸癌肝轉移5例，結腸癌淋巴結轉移25例，正常結腸、肝及淋巴結各3例，一例一點。陣列點直徑1．5mm，厚度5μm。詳細材料見表1．

1．2 免疫組織化學染色

一抗兔抗人nucleolin和兔抗人VEGF多克隆抗體，購自ProteinTech Group公司，采用1:250的比例稀釋。SP免疫組織化學法，以PBS液替代一抗做陰性對照，以試劑公司提供的陽性樣品做陽性對照。免疫組化結果采用OLYMPUS公司全自動顯微鏡照相裝置采集。光鏡下nucleolin和VEGF陽性表達主要呈棕色或棕黃色顆粒。評分標準采用半定量評分［8］:①按染色強度評分，基本不著色者為0分，著色淡者為1分，著色適中者為2分。②按照視野內陽性細胞數，陽性率=陽性細胞/總細胞數×100%。＜5%為0分，5～25%為1分，26～50%為2分，＞50%為3分。以兩種評分的乘積作為免疫組化半定量得分，≤1分判定為陰性，≥2分判定為陽性。

1．3 統計學分析

采用SPSS17．0軟件進行統計學處理，采用X2檢驗對定性資料進行統計分析，以P=0．05為檢驗標準，P＜0．05，差異具有統計學意義。

2 結果

2．1 Nucleolin和VEGF在正常結腸組織、結腸癌組織和轉移性結腸癌組織中的表達

光鏡下，VEGF陽性表達于細胞漿，在正常結腸組織、結腸癌組織和轉移性結腸癌組織中的平均評分為3．85 ±0．47、4．93 ±0．40 和6．80 ±0．70，差異具有統計學意義(P＜0．05)。VEGF在轉移結腸癌中的表達顯著高于結腸癌(P＜0．05)。Nucleolin表達于細胞核、細胞漿和細胞膜，在正常結腸組織、結腸癌組織和轉移性結腸癌組織中的總評分分別為2．65±0．47、3．43 ±0．55、4．03 ±0．65，Nucleolin 總的表達水平在正常結腸組織和結腸癌組織中差異具有統計學意義(P＜0．05)，但是在結腸癌和轉移性結腸癌組織中的差異不具有統計學意義(P＞0．05)(見圖1)。

2．2 Nucleolin和VEGF的表達與結腸癌臨床病理特征的關系

VEGF在轉移性結腸癌中的表達顯著高于結腸癌(P＜0．05)，與患者年齡、性別無相關性(P＞0．05)，與組織的分化程度、TNM病理分期無相關性(P＞0．05)?？偟腘ucleolin的表達水平在轉移性結腸癌與原位結腸癌中無顯著性差別(P＞0．05)，與患者年齡、性別無相關性(P＞0．05)，與組織的分化程度、TNM病理分期無相關性(P＞0．05)(見表1)。

圖1 Nucleolin和VEGF在正常組織和結腸癌組織中的表達情況

表1 Nucleolin和VEGF的表達與結腸癌臨床病理特征的關系

2．3 Nucleolin在轉移性結腸腺癌中亞細胞表達部位的改變及其與VEGF的關系

Nucleolin蛋白表達水平在結腸癌和淋巴結轉移及肝轉移的結腸癌組織中差異無統計學意義(P＞0．05)，但是，與原發結腸癌相比，在轉移性結腸癌中，Nucleolin核著色減弱，胞漿和胞膜著色增強。VEGF在淋巴結轉移和肝轉移的結腸癌組織中的表達水平顯著高于原位結腸癌組織(4．93 ±0．40，6．80 ±0．70，P=0．02)，且肝轉移灶中表達水平更高(見圖2)。這一結果提示，Nucleolin蛋白在轉移性結腸腺癌中的亞細胞表達部位的改變可能和VEGF相關。

2 討論

結腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，隨著生活水平的提高，結腸癌在我國的發病率呈現逐年上升的趨勢，已嚴重威脅人類健康。目前手術是結腸癌最有效的治療方法，結腸癌術后的復發和轉移所導致的相關并發癥是結腸癌患者的主要死因［2］。腫瘤侵襲轉移過程是多階段的、復雜的、具有高度選擇性的過程。它涉及腫瘤細胞本身與宿主之間錯綜復雜的關系，腫瘤血管生成和宿主免疫系統的各種反應，并受多種相關基因的調控，其確切機制尚未明了，是目前腫瘤研究的熱點和難點之一［9］。

VEGF在腫瘤形成和生長及在轉移瘤的形成中起著十分重要的作用，在許多人類腫瘤中，VEGF的表達水平與患者的生存期密切相關。VEGF的表達受到許多信號通路的調節，包括低氧、激素以及細胞因子的刺激。同時，也會取決于細胞的環境，如活化的癌基因的刺激［10］。

Nucleolin是真核細胞核仁中最主要的一種蛋白質，可以調控核糖體的生物合成與成熟，細胞增殖生長、胚胎發生、胞質分裂、染色體復制與核仁發生等過程［4］。腫瘤細胞表面的Nucleolin可作為細胞的受體，與多種配體相結合，參與腫瘤細胞的信號傳導［5-6］。已有文章報道，Nucleolin是血管內皮抑素的新型功能性受體，血管內皮抑素與新生血管的內皮細胞膜上的Nucleolin高親和性結合后內化，轉運入核，抑制Nucleolin的磷酸化，從而抑制血管內皮細胞增殖的過程，抑制腫瘤新生血管生成［8］。同時，腫瘤細胞膜表面的Nucleolin也與胃癌和胰腺癌患者的預后相關［11］。

圖2 Nucleolin和VEGF在轉移性結腸腺癌中發生表達改變

在本文中，我們采用結腸癌組織芯片，通過免疫組化方法檢測了Nucleolin和VEGF在結腸癌、轉移性結腸癌和癌旁正常組織中的表達。結果顯示，VEGF陽性表達于細胞漿，在結腸癌組織和轉移性結腸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常結腸組織(P＜0．05)，轉移性結腸癌組織中的表達顯著高于無轉移的結腸癌組織(P＜0．05)。Nucleolin主要表達于細胞核，也在細胞漿和細胞膜有部分表達，Nucleolin總的表達水平在正常結腸組織和結腸癌組織中差異具有統計學意義(P＜0．05)，但是在結腸癌和轉移性結腸癌組織中的差異不具有統計學意義(P＞0．05)。VEGF和總的Nucleolin的表達水平與患者年齡、性別無相關性(P＞0．05)，與組織的分化程度、TNM病理分期無相關性(P＞0．05)。但是，在轉移性結腸癌中，Nucleolin核著色減弱，胞漿和胞膜著色增強。VEGF在淋巴結轉移和肝轉移的結腸癌組織中的表達水平顯著高于原位結腸癌組織(P=0．02)，且肝轉移灶中表達水平更高，兩者變化趨勢一致，這一結果提示，Nucleolin蛋白從細胞核到細胞漿和細胞膜的轉位可能和結腸癌的侵襲轉移相關，VEGF相關信號通路可能參與了這一過程。

綜上，Nucleolin蛋白胞核向胞膜的轉位與結腸癌的轉移相關，VEGF可能參與了這一過程，Nucleolin有望成為結腸癌侵襲轉移治療的有效靶點。

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